為生產(chǎn)具有特定性能的α淀粉酶，研究人員從某種海洋細(xì)菌中克隆了α淀粉酶基因（1656個堿基對），利用基因工程大量制備α淀粉酶，實驗流程見圖。請回答下列問題：
（1）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增α淀粉酶基因前，需先獲得細(xì)菌的

基因組DNA

基因組DNA

。
（2）為了便于擴(kuò)增的DNA片段與表達(dá)載體連接，需在引物的

5′

5′

端加上限制性酶切位點(diǎn)，且常在兩條引物上設(shè)計加入不同的限制性酶切位點(diǎn)，主要目的是

使DNA片段能定向插入表達(dá)載體，減少自連

使DNA片段能定向插入表達(dá)載體，減少自連

。
（3）進(jìn)行擴(kuò)增時，反應(yīng)的溫度和時間需根據(jù)具體情況進(jìn)行設(shè)定，下列選項中

②

②

的設(shè)定與引物有關(guān)，

⑥

⑥

的設(shè)定與擴(kuò)增片段的長度有關(guān)。（填序號）
①變性溫度
②退火溫度
③延伸溫度
④變性時間
⑤退火時間
⑥延伸時間