研究表明，腸道菌群失調(diào)會導(dǎo)致肥胖、腸炎等的發(fā)生，通過移植基因工程改造的腸道菌能有效緩解上述癥狀。實(shí)驗(yàn)過程如下：首先從實(shí)驗(yàn)小鼠腸道中提取大腸桿菌，然后將熒光蛋白（GFP）基因與能影響小鼠代謝的膽鹽水解酶（BSH）基因連接并導(dǎo)入上述大腸桿菌，使其融合表達(dá)，通過飼管將轉(zhuǎn)基因大腸桿菌移植到腸道菌群失調(diào)的小鼠腸道中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大部分小鼠的肥胖、腸炎等癥狀得到緩解。
（1）研究人員利用具有互補(bǔ)末端的引物，使BSH基因與GFP基因的PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈，通過重疊鏈的延伸，將BSH基因與GFP基因重疊拼接起來形成融合基因。BSH基因與GFP基因的部分堿基序列及融合基因的形成過程如圖所示：

①GFP基因的存在有利于檢測目的基因是否完成

轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)化

。圖中引物2和引物3的黑、白區(qū)域分別包含10個(gè)脫氧核苷酸序列，由圖可知引物2的序列為

3'TCAATTGATTCCATGATCAT5'

3'TCAATTGATTCCATGATCAT5'

（標(biāo)注5'和3'）；相比于在引物一端添加特定的限制酶識別序列，這樣設(shè)計(jì)引物的優(yōu)點(diǎn)是

無目的基因以外的其他DNA序列（或無限制酶識別切割后的剩余序列）

無目的基因以外的其他DNA序列（或無限制酶識別切割后的剩余序列）

，從而有效避免因加入限制酶識別序列可能導(dǎo)致的目的基因表達(dá)蛋白功能異常。
②第一步中經(jīng)過

2

2

次擴(kuò)增方可得到含有重疊序列的BSH基因與GFP基因，將其經(jīng)第二步混合、變性后雜交，所獲得的

雜交產(chǎn)物2

雜交產(chǎn)物2

（填“雜交產(chǎn)物1”或“雜交產(chǎn)物2”）在DNA聚合酶作用下進(jìn)一步延伸形成BSH和GFP的融合基因，另一種雜交產(chǎn)物不能延伸形成融合基因的原因是

雜交產(chǎn)物1只能提供5’端，DNA聚合酶只能從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸

雜交產(chǎn)物1只能提供5’端，DNA聚合酶只能從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸

。
（2）實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)部分小鼠的癥狀改善不明顯，研究人員推測可能是因?yàn)榇竽c桿菌細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控蛋白P與BSH基因的啟動子結(jié)合，影響了BSH基因的表達(dá)水平。為驗(yàn)證上述推測，研究人員利用質(zhì)粒B（含啟動子被破壞的金擔(dān)子素抗性基因）、質(zhì)粒G（不含金擔(dān)子素抗性基因）、不能合成尿嘧啶的代謝缺陷型酵母菌等進(jìn)行如下操作：①將BSH基因的啟動子拼接到質(zhì)粒B中金擔(dān)子素抗性基因上游構(gòu)建重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入代謝缺陷型酵母菌中，置于不含尿嘧啶、含金擔(dān)子素的培養(yǎng)基中篩選出成功轉(zhuǎn)化的酵母菌群Y1。由此推測質(zhì)粒B上應(yīng)具有的標(biāo)記基因是

尿嘧啶合成基因

尿嘧啶合成基因

；②將從大腸桿菌中提取的調(diào)控蛋白P基因與質(zhì)粒G連接后導(dǎo)入代謝缺陷型酵母菌中，置于特定的選擇培養(yǎng)基中獲得細(xì)胞內(nèi)已表達(dá)出調(diào)控蛋白P的酵母菌群Y2；③提供條件使Y1與Y2相互靠攏后融合形成接合子；④將接合子均分為兩組，一組接種在不含尿嘧啶、不含金擔(dān)子素的培養(yǎng)基中，觀察接合子的生存情況，預(yù)期結(jié)果是

接合子能生存

接合子能生存

；另一組接種在不含尿嘧啶、含金擔(dān)子素的培養(yǎng)基中，觀察接合子的生存情況，預(yù)期結(jié)果是

接合子不能生存（或生存能力極弱）

接合子不能生存（或生存能力極弱）

，理由是

接合子表達(dá)出的調(diào)控蛋白P，與BSH啟動子結(jié)合后抑制了金擔(dān)子素抗性基因的表達(dá)，使接合子不具有對金擔(dān)子素的抗性或抗性弱

接合子表達(dá)出的調(diào)控蛋白P，與BSH啟動子結(jié)合后抑制了金擔(dān)子素抗性基因的表達(dá)，使接合子不具有對金擔(dān)子素的抗性或抗性弱

。