酵母菌絮凝是指菌體細(xì)胞間通過細(xì)胞壁相互粘附、聚集成團(tuán)的現(xiàn)象。適當(dāng)提高酵母的絮凝能力，有助于發(fā)酵后細(xì)胞和產(chǎn)物的分離，節(jié)約生產(chǎn)成本?？蒲腥藛T為研究R基因?qū)湍妇跄阅艿挠绊?，用基因工程技術(shù)獲得了R基因被敲除的酵母菌菌株，主要步驟如圖1（G418為一種氨基糖苷類抗生素）。據(jù)圖回答：

（1）過程①，引物2和引物4分別添加了MluⅠ的識(shí)別序列，則引物1和引物3的5'端分別添加

BamHⅠ、HindⅢ

BamHⅠ、HindⅢ

的識(shí)別序列，PCR獲取R基因左右兩端的N和C片段過程中，除圖中條件外，還需提供

dNTP、Taq酶、緩沖液、Mg²⁺

dNTP、Taq酶、緩沖液、Mg²⁺

等條件（至少寫三個(gè)）。
（2）利用含

G418

G418

的培養(yǎng)基篩選出重組酵母，再挑取單菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證酵母細(xì)胞R基因是否被敲除，則擴(kuò)增時(shí)選擇引物組合是

引物1和引物3

引物1和引物3

。
（3）科研人員繼續(xù)將野生酵母菌和R基因敲除酵母菌的菌液接種到裝有麥芽汁的錐形瓶中，一定條件下靜置發(fā)酵7天，測(cè)定酒精發(fā)酵能力和絮凝能力，結(jié)果如下表。

指標(biāo)種類	酒精發(fā)酵能力	絮凝能力
野生酵母菌	4.5%	63.1%
R基因敲除酵母菌	4.5%	83.1%

①酒精發(fā)酵期間，每個(gè)錐形瓶應(yīng)注意保持

密封

密封

條件和定期排氣。
②實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，R基因敲除酵母菌是否符合生產(chǎn)需求？請(qǐng)說(shuō)出你的判斷依據(jù)。

符合，R基因敲除后酵母菌的發(fā)酵能力不變，而絮凝能力增強(qiáng)

符合，R基因敲除后酵母菌的發(fā)酵能力不變，而絮凝能力增強(qiáng)

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（4）科研人員又將不同濃度梯度的R基因敲除酵母菌菌液和野生酵母菌菌液點(diǎn)樣于含30g/mL鈣熒光白（細(xì)胞壁抑制劑，破壞細(xì)胞壁的正常組裝）的YPD培養(yǎng)基上，結(jié)果如圖2。推測(cè)R基因敲除酵母菌絮凝能力變化的原因是

R基因缺失增強(qiáng)了酵母菌對(duì)細(xì)胞壁抑制劑的耐性，絮凝能力增強(qiáng)

R基因缺失增強(qiáng)了酵母菌對(duì)細(xì)胞壁抑制劑的耐性，絮凝能力增強(qiáng)

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