基因定點(diǎn)整合可替換特定基因，該技術(shù)可用于單基因遺傳病的治療。苯丙酮尿癥是由PKU基因突變引起的，將正常PKU基因定點(diǎn)整合到PKU基因突變的小鼠胚胎干細(xì)胞的染色體DNA上，替換突變基因，可用來研究該病的基因治療過程。定點(diǎn)整合的過程是：從染色體DNA上突變PKU基因兩側(cè)各選擇一段DNA序列HB1和HB2，根據(jù)其堿基序列分別合成HB1和HB2，再將兩者分別與基因HSV-tkl、HSV-tk2連接，中間插入正常PKU基因和標(biāo)記基因neo^r，構(gòu)建出如圖所示的重組載體。重組載體和染色體DNA中的HB1和HB2序列發(fā)生交換，導(dǎo)致兩者之間區(qū)域發(fā)生互換，如圖所示。

（1）構(gòu)建重組載體時(shí)，常用的工具酶有

限制酶、DNA連接酶

限制酶、DNA連接酶

。該實(shí)驗(yàn)用小鼠胚胎干細(xì)胞作為PKU基因的受體細(xì)胞以培育出轉(zhuǎn)基因小鼠，除了胚胎干細(xì)胞能大量增殖外，還因?yàn)榕咛ジ杉?xì)胞

具有發(fā)育的全能性

具有發(fā)育的全能性

。
（2）為獲得小鼠的胚胎干細(xì)胞，可將小鼠囊胚中的

內(nèi)細(xì)胞團(tuán)

內(nèi)細(xì)胞團(tuán)

取出，并用

胰蛋白酶或膠原蛋白酶

胰蛋白酶或膠原蛋白酶

處理使其分散成單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中大部分細(xì)胞會(huì)貼附在培養(yǎng)瓶的表面生長(zhǎng)，這種現(xiàn)象稱為

貼壁生長(zhǎng)

貼壁生長(zhǎng)

。
（3）用圖中重組載體轉(zhuǎn)化胚胎干細(xì)胞時(shí)，會(huì)出現(xiàn)PKU基因錯(cuò)誤整合。錯(cuò)誤整合時(shí)，載體的兩個(gè)HSV-tk中至少會(huì)有一個(gè)與neo^r一起整合到染色體DNA上。已知含有neo^r的細(xì)胞具有G418的抗性。HSV-tkl、HSV-tk2的產(chǎn)物都能把DHPG轉(zhuǎn)化成有毒物質(zhì)而使細(xì)胞死亡。轉(zhuǎn)化后的胚胎干細(xì)胞依次在含有G418及同時(shí)含有G418和DHPG的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，在雙重選擇下存活下來的是

正確整合（含neo^r而不含HSV-tk ）

正確整合（含neo^r而不含HSV-tk ）

的胚胎干細(xì)胞，理由是

能在含有G418的培養(yǎng)液存活說明轉(zhuǎn)化后的胚胎干細(xì)胞中含neo^r，能在含DHPG的培養(yǎng)液中存活說明轉(zhuǎn)化后的胚胎干細(xì)胞中不含HSV-tk

能在含有G418的培養(yǎng)液存活說明轉(zhuǎn)化后的胚胎干細(xì)胞中含neo^r，能在含DHPG的培養(yǎng)液中存活說明轉(zhuǎn)化后的胚胎干細(xì)胞中不含HSV-tk

。
（4）將篩選得到的胚胎干細(xì)胞培育成小鼠，從個(gè)體生物學(xué)水平檢測(cè)，若小鼠

尿液中不含大量苯丙酮酸

尿液中不含大量苯丙酮酸

，說明PKU基因成功表達(dá)。