人類γ基因啟動子上游的調(diào)控序列中含有BCL11A蛋白結(jié)合位點，該位點結(jié)合BCL11A蛋白后，基因的表達被抑制。通過改變該結(jié)合位點的序列，解除對γ基因表達的抑制，可對某種地中海貧血癥進行基因治療?？蒲腥藛T擴增了γ基因上游不同長度的片段，將這些片段分別插入表達載體中進行轉(zhuǎn)化和熒光檢測，以確定BCL11A蛋白結(jié)合位點的具體位置。相關(guān)信息如圖所示。

（1）為將擴增后的產(chǎn)物定向插入載體指導熒光蛋白基因表達，需要用限制酶

MunⅠ和XhoⅠ

MunⅠ和XhoⅠ

對圖所示載體的部分結(jié)構(gòu)進行酶切處理，這樣選擇的理由是

選擇這兩個酶不會破壞熒光蛋白基因（或Nhe和EcoRI會切割熒光蛋白基因），且二者黏性末端序列不同，能幫助γ基因上游序列定向連接；

選擇這兩個酶不會破壞熒光蛋白基因（或Nhe和EcoRI會切割熒光蛋白基因），且二者黏性末端序列不同，能幫助γ基因上游序列定向連接；

；在對γ基因上游片段進行擴增時，需在引物

5’端

5’端

末端添加限制酶識別序列，據(jù)圖可知，在F₁～F₇末端添加的序列所對應(yīng)的限制酶是

SalⅠ

SalⅠ

。在R末端添加的序列所對應(yīng)的限制酶是

EcoRⅠ

EcoRⅠ

，這樣選擇的理由是

SalⅠ和XhoⅠ互為同尾酶，EcoRⅠ和MunⅠ互為同尾酶，擴增產(chǎn)物經(jīng)相應(yīng)酶切后所得有效片段唯一且可定向連接于熒光蛋白基因上游并能對熒光蛋白基因進行正確轉(zhuǎn)錄（或由右向左進行轉(zhuǎn)錄）

SalⅠ和XhoⅠ互為同尾酶，EcoRⅠ和MunⅠ互為同尾酶，擴增產(chǎn)物經(jīng)相應(yīng)酶切后所得有效片段唯一且可定向連接于熒光蛋白基因上游并能對熒光蛋白基因進行正確轉(zhuǎn)錄（或由右向左進行轉(zhuǎn)錄）

。綜上所述本實驗中，從產(chǎn)物擴增到載體構(gòu)建完成的整個過程共需要

6

6

種酶。
（2）將構(gòu)建的載體導入除去BCL11A基因的受體細胞，成功轉(zhuǎn)化后，含F(xiàn)1～F6與R擴增產(chǎn)物的載體表達熒光蛋白，受體細胞有熒光，含F(xiàn)7與R擴增產(chǎn)物的受體細胞無熒光。含F(xiàn)7與R擴增產(chǎn)物的受體細胞無熒光的原因是

F₇與R擴增產(chǎn)物不含完整的啟動子，熒光蛋白基因不表達

F₇與R擴增產(chǎn)物不含完整的啟動子，熒光蛋白基因不表達

。
（3）向培養(yǎng)液中添加適量的雌激素，含F(xiàn)1～F4與R擴增產(chǎn)物的受體細胞不再有熒光。而含F(xiàn)5～F6與R擴增產(chǎn)物的受體細胞仍有熒光。若γ基因上游調(diào)控序列上與引物序列所對應(yīng)的位置不含有BCL11A蛋白的結(jié)合位點序列，據(jù)此結(jié)果可推測。BCL11A蛋白結(jié)合位點位于

引物F₄與F₅在調(diào)控序列上所對應(yīng)序列之間的區(qū)段上

引物F₄與F₅在調(diào)控序列上所對應(yīng)序列之間的區(qū)段上

，理由是

根據(jù)有無熒光情況判斷，F(xiàn)₁～F₄與R擴增產(chǎn)物上均有結(jié)合位點，因此結(jié)合位點位于F₄所對應(yīng)調(diào)控序列的下游（右側(cè)）；F₅～F₆與R擴增產(chǎn)物上均無結(jié)合位點，可知結(jié)合位點位于F₅所對應(yīng)調(diào)控序列的上游（左側(cè)），所以結(jié)合位點位于引物F₄與F₅在調(diào)控序列上所對應(yīng)序列之間的區(qū)段上

根據(jù)有無熒光情況判斷，F(xiàn)₁～F₄與R擴增產(chǎn)物上均有結(jié)合位點，因此結(jié)合位點位于F₄所對應(yīng)調(diào)控序列的下游（右側(cè)）；F₅～F₆與R擴增產(chǎn)物上均無結(jié)合位點，可知結(jié)合位點位于F₅所對應(yīng)調(diào)控序列的上游（左側(cè)），所以結(jié)合位點位于引物F₄與F₅在調(diào)控序列上所對應(yīng)序列之間的區(qū)段上

。