異丁醇具有燃值高、能量密度高等優(yōu)點，其開發(fā)和利用對優(yōu)化我國能源結(jié)構(gòu)和保護環(huán)境有非常重要的戰(zhàn)略意義。基于釀酒酵母的發(fā)酵途徑（圖甲）和圖乙的質(zhì)粒，研究者構(gòu)建了一種表達載體pUC18，用于過表達ILV2、ILV5、ILV3、AR010基因，以實現(xiàn)異丁醇的大規(guī)模生產(chǎn)。已知氨芐青霉素能抑制細菌細胞壁的形成。據(jù)此回答下列問題：

（1）圖乙質(zhì)粒上有多個限制酶切位點，作用是

便于插入多種外源基因

便于插入多種外源基因

。研究人員先用pUC18轉(zhuǎn)化經(jīng)

Ca²⁺處理

Ca²⁺處理

（處理方法）的大腸桿菌，以便篩選、鑒定擴增重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒上有

原核生物的復(fù)制原點

原核生物的復(fù)制原點

，所以能在大腸桿菌中擴增。
（2）將環(huán)狀載體pUC18導(dǎo)入釀酒酵母時，一般會將其進行酶切得到線性化載體，隨后再將其導(dǎo)入受體細胞。根據(jù)所學(xué)的知識推測酶切得到線性化載體的目的是

線性化載體能整合到釀酒酵母染色體DNA，從而能更穩(wěn)定存在并發(fā)揮功能

線性化載體能整合到釀酒酵母染色體DNA，從而能更穩(wěn)定存在并發(fā)揮功能

。
（3）提取成功構(gòu)建的表達載體并導(dǎo)入不能合成組氨酸的釀酒酵母菌株，將菌株接種在培養(yǎng)基中以獲得單菌落，該過程稱為微生物的

選擇

選擇

培養(yǎng)。培養(yǎng)基中需要添加的物質(zhì)有

c

c

。
（用下列字母填寫：a.組氨酸、b.氨芐青霉素、c瓊脂）。
（4）異丁醇的大量積累會傷害細胞，研究人員給該工程菌導(dǎo)入一個經(jīng)改造的光敏蛋白基因，使工程菌對特定的藍光敏感。進行不同的光照處理，使其在異丁酵產(chǎn)生階段和生長繁殖階段進行切換，結(jié)果如下圖丙所示。

注：5/10/20h pulse分別代表在黑暗條件下每隔5、10、20h發(fā)出15s和65s的藍光脈沖30min
①對照組的酵母菌需要導(dǎo)入

不含光敏蛋白基因的空載體

不含光敏蛋白基因的空載體

。
②以葡萄糖為碳源，利用該轉(zhuǎn)基因釀酒酵母進行發(fā)酵時，若想進一步提高其異丁醇產(chǎn)量，
綜合圖甲和圖乙信息，分別寫出進一步優(yōu)化菌株和工藝的措施（各一點）

敲除該工程菌的ADHs和ALDs基因，在黑暗條件下每隔10h發(fā)出15s和65s的藍光脈沖30min

敲除該工程菌的ADHs和ALDs基因，在黑暗條件下每隔10h發(fā)出15s和65s的藍光脈沖30min

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