基因組中大片段DNA的定向整合擁有廣闊的應(yīng)用前景，目前細(xì)菌中的定向整合系統(tǒng)存在諸多不足，如效率偏低，缺乏有效的篩選標(biāo)記物，可整合的片段大小有限（3～4kb）等。研究者嘗試構(gòu)建CRISPR RNA-guided定向整合系統(tǒng)以改善上述缺陷。
（1）Cas蛋白是一種RNA引導(dǎo)的內(nèi)切酶，能催化雙鏈DNA在特定位點(diǎn)斷裂。crRNA是一種短鏈RNA，它一端可與Cas蛋白結(jié)合，另一端通過
堿基互補(bǔ)配對(duì)
堿基互補(bǔ)配對(duì)
原則與目標(biāo)DNA序列結(jié)合。
（2）轉(zhuǎn)座子（Tn）是一段特殊的DNA片段。轉(zhuǎn)座酶A和轉(zhuǎn)座酶B相互結(jié)合后可將Tn從原有的DNA鏈上切下，并將其整合到其他DNA片段上。為了使轉(zhuǎn)座子定向整合到特定的位置，研究者構(gòu)建了圖1所示的CRISPR RNA-guided定向整合系統(tǒng)，導(dǎo)入大腸桿菌，并統(tǒng)計(jì)定向整合的效率，結(jié)果如圖2。
①構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，應(yīng)將翻譯終止序列設(shè)置在Cas基因和轉(zhuǎn)座酶A基因之后而不是設(shè)置在兩者之間，目的是 讓Cas蛋白和轉(zhuǎn)座酶A形成融合蛋白，便于Cas蛋白引導(dǎo)轉(zhuǎn)座酶定位到crRNA所結(jié)合的DNA附近，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子的定向整合
讓Cas蛋白和轉(zhuǎn)座酶A形成融合蛋白，便于Cas蛋白引導(dǎo)轉(zhuǎn)座酶定位到crRNA所結(jié)合的DNA附近，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子的定向整合
。
②由圖2結(jié)果可知，轉(zhuǎn)座子的定向整合效率高低與 轉(zhuǎn)座子整合的方向
轉(zhuǎn)座子整合的方向
密切相關(guān)。為保證轉(zhuǎn)座子連接方向與預(yù)期相同，構(gòu)建重組質(zhì)粒的過程中，對(duì)切割轉(zhuǎn)座子和切割載體的限制酶的要求是 利用兩種不同的限制酶切割轉(zhuǎn)座子和載體，且保證黏性末端的連接方向與預(yù)期相同
利用兩種不同的限制酶切割轉(zhuǎn)座子和載體，且保證黏性末端的連接方向與預(yù)期相同
。
③由圖2結(jié)果可知，該系統(tǒng)還能有效解決篩選標(biāo)記物缺乏的問題，理由是 RL方向的定向整合效率接近100%，無需再用標(biāo)記物進(jìn)行篩選
RL方向的定向整合效率接近100%，無需再用標(biāo)記物進(jìn)行篩選
。
（3）研究者替換了不同長(zhǎng)度的轉(zhuǎn)座子，繼續(xù)檢測(cè)定向整合效率，結(jié)果如圖3。
與現(xiàn)有的定向整合系統(tǒng)相比，CRISPR RNA-guided定向整合系統(tǒng)可整合的片段大小得到提高，判斷依據(jù)是 當(dāng)轉(zhuǎn)座子長(zhǎng)度大于3～4kb時(shí)，定向整合效率依然接近100%
當(dāng)轉(zhuǎn)座子長(zhǎng)度大于3～4kb時(shí)，定向整合效率依然接近100%
。
（4）利用該系統(tǒng)能實(shí)現(xiàn)基因定向整合的特點(diǎn)，舉例說出其在科學(xué)研究中還可以有哪些應(yīng)用：將轉(zhuǎn)座子插入特定基因，破壞該基因的結(jié)構(gòu)，形成基因缺陷突變體，用以研究該基因的功能
將轉(zhuǎn)座子插入特定基因，破壞該基因的結(jié)構(gòu)，形成基因缺陷突變體，用以研究該基因的功能
。（舉出一例即可）
