銅綠假單胞菌常常引起禽類、水貂等發(fā)生敗血癥及呼吸系統(tǒng)感染等疾病，給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重損失。科研人員嘗試克隆和表達該菌外膜蛋白oprD基因，以用于后期的疫苗研制工作。相關(guān)限制酶識別序列及用于構(gòu)建基因表達載體的質(zhì)粒圖示如下，其中Amp“表示氨芐青霉素抗性基因，請回答下列問題：

限制酶	識別序列
BamHI	5'G↓GATCC3'
EcoRI	5'G↓A ATTC3'
Not I	5'GC↓GGCCGC3
XhoI	5'C↓TCGAG3'

（1）質(zhì)粒的基本單位是

脫氧核苷酸

脫氧核苷酸

，一個質(zhì)粒分子中通常含

0

0

個游離的磷酸基團。Amp基因常作為基因工程中的標記基因，標記基因的作用是

供重組DNA的鑒定與選擇

供重組DNA的鑒定與選擇

。
（2）若已知銅綠假單胞菌的oprD基因序列，可利用

PCR

PCR

技術(shù)快速大量擴增該基因。為便于擴增的oprD基因與表達載體的連接，在設(shè)計引物時，常在兩條引物的

5′

5′

端加上限制酶的識別序列，設(shè)計后的引物如下：
引物1：5'-CGGGATCCATGAAAGTGATGAAGTGG-3'；
引物2：5'-CCCTCGAGTTACAGGATCGACAGCGG-3'。
（3）根據(jù)上題中的引物信息分析，在構(gòu)建oprD基因表達載體時，可選擇

BamHⅠ

BamHⅠ

和

XhoⅠ

XhoⅠ

兩種不同的限制酶同時切割目的基因和質(zhì)粒，以提高目的基因和質(zhì)粒的重組效率。
（4）將目的基因?qū)氪竽c桿菌時，一般先用Ca²⁺溶液處理大腸桿菌，使細胞處于

能吸收周圍DNA分子

能吸收周圍DNA分子

的生理狀態(tài)即感受態(tài)。