塑料中含有的雙酚A（BPA）可在生物體內(nèi)富集，導(dǎo)致生物體內(nèi)分泌系統(tǒng)失衡和紊亂。漆酶是一類藍(lán)色胞外含銅多酚氧化酶，能使愈創(chuàng)木酚氧化產(chǎn)生紅褐色物質(zhì)，能有效降解BPA，廣泛分布于白腐真菌中?？蒲腥藛T欲從土壤中篩選和分離出高產(chǎn)漆酶的菌株，構(gòu)建高效的BPA處理方法，實(shí)驗(yàn)思路。
（1）培養(yǎng)基的配制：
PDA培養(yǎng)基：土豆20%+葡萄糖20%+瓊脂2%+水：
G-PDA培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基+0.04%愈創(chuàng)木酚+100μg/mL氨芐青霉素；
（2）菌種的分離：
采集林下土樣加入

無(wú)菌水

無(wú)菌水

制成土壤懸液，利用

涂布分離

涂布分離

法接種于G-PDA培養(yǎng)基平板上，將其

倒置

倒置

于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24h觀察

變色圈大小、顏色深淺、顯色時(shí)間

變色圈大小、顏色深淺、顯色時(shí)間

等指標(biāo)來(lái)衡量產(chǎn)漆酶的能力。
（3）粗酶液的制備：
將分離出的菌株接種于液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30℃恒溫振蕩培養(yǎng)7d,培養(yǎng)液經(jīng)離心后取

上清液

上清液

作為粗酶液。漆酶的產(chǎn)量受發(fā)酵液初始pH、培養(yǎng)溫度

碳源的種類和濃度、氮源的種類和濃度、Cu²⁺濃度、培養(yǎng)時(shí)間

碳源的種類和濃度、氮源的種類和濃度、Cu²⁺濃度、培養(yǎng)時(shí)間

 （至少兩點(diǎn)）因素的影響。
（4）酶的應(yīng)用：
游離的漆酶的催化活性易受環(huán)境因素等影響，且難

重復(fù)使用

重復(fù)使用

，利

固定化酶

固定化酶

技術(shù)，可顯著增強(qiáng)漆酶的利用率和對(duì)廢水中BPA的去除效益。
（二）自然界中只有極少數(shù)原核微生物能固氮，而大多數(shù)農(nóng)作物不具備固氮能力，近些年來(lái)人們嘗試通過植物細(xì)胞工程的兩條途徑來(lái)培養(yǎng)固氮植株。
（1）途徑一：
①獲得目的基因：若固氮基因片段是已知的，可用

PCR （擴(kuò)增）

PCR （擴(kuò)增）

或

化學(xué)合成

化學(xué)合成

方法獲得。
②形成重組DNA分子并導(dǎo)入受體細(xì)胞：將固氮基因與載體DNA連接在-起，常選用

Ti質(zhì)粒

Ti質(zhì)粒

作為該基因的載體使用，之后把形成的重組DNA分子導(dǎo)入植物細(xì)胞：
③篩選與表達(dá)：若受體細(xì)胞轉(zhuǎn)入

無(wú)氮（源）

無(wú)氮（源）

培養(yǎng)基中仍能繼續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育，說(shuō)明固氮基因已在受體細(xì)胞中表達(dá)；
④植物組織培養(yǎng)：分離上述成功表達(dá)固氮基因的單個(gè)植物細(xì)胞，經(jīng)過培養(yǎng)基中成分誘導(dǎo)，可發(fā)生類似受精卵經(jīng)過卵裂、分化、

器官發(fā)生

器官發(fā)生

和形態(tài)建成而發(fā)育成胚的過程，之后培養(yǎng)獲得具有固氮能力試管苗.
（2）途徑二：將植物細(xì)胞

纖維素酶和果膠

纖維素酶和果膠

酶處理得到的原生質(zhì)體與去壁后的固氮菌進(jìn)行

細(xì)胞融合

細(xì)胞融合

，再通過培養(yǎng)獲得具有固氮能力的試管苗。
（3）上述兩條途徑獲得的試管苗數(shù)量不夠，需在初代培養(yǎng)后連續(xù)數(shù)代擴(kuò)大繁殖，

繼代培養(yǎng)

繼代培養(yǎng)

過程。