纖維二糖酶可以將纖維二糖分解成葡萄糖和其他單糖。將來源于黑曲霉的纖維二糖酶基因 （CB） 和強(qiáng)啟動(dòng)子Pcbh1、終止子Tcbh1構(gòu)建成重組質(zhì)粒，獲得了高效表達(dá)纖維二糖酶的里氏木霉優(yōu)勢(shì)菌株。請(qǐng)回答下列問題：
（1）科研人員利用PCR擴(kuò)增黑曲霉的CB，請(qǐng)完成表格。
| PCR項(xiàng)目 |
相關(guān)操作 |
| 緩沖液 |
PCR反應(yīng)緩沖液中一般要添加①
Mg2+ Mg2+ |
| 模板、引物、原料和酶 |
提供DNA模板、2種引物、dNTP和Taq酶 |
| 反應(yīng)過程 |
每次循環(huán)依次分為② 變性、復(fù)性和延伸 變性、復(fù)性和延伸 三步 |
| 循環(huán)次數(shù) |
一次PCR一般要經(jīng)歷30次循環(huán) |
| 產(chǎn)物鑒定 |
常采用③ 瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖凝膠電泳 方法來鑒定PCR的產(chǎn)物 |
（2）為將CB以正確方向插入質(zhì)粒需要雙酶切。已知CB的α鏈為轉(zhuǎn)錄的模板鏈，應(yīng)在圖1中引物
2
2
的
5'
5'
端加入EcoRⅠ的識(shí)別序列，理由是
a鏈為轉(zhuǎn)錄的模板鏈，該鏈在強(qiáng)啟動(dòng)子PcbhI后的方向應(yīng)為3'→5’，因此引物2應(yīng)位于CB的上游，為使子鏈從引物2的3’端延伸，其5’端應(yīng)構(gòu)建EcoRI的酶切位點(diǎn)
a鏈為轉(zhuǎn)錄的模板鏈，該鏈在強(qiáng)啟動(dòng)子PcbhI后的方向應(yīng)為3'→5’，因此引物2應(yīng)位于CB的上游，為使子鏈從引物2的3’端延伸，其5’端應(yīng)構(gòu)建EcoRI的酶切位點(diǎn)
。
（3）為研究磷脂酶（PLC-E）與纖維二糖酶基因表達(dá)的關(guān)系，研究者構(gòu)建了高效沉默PLC-E基因的反向雙啟動(dòng)子載體，如圖3所示，其中TrpC和 Rp2為啟動(dòng)子，eGFP為增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因，eGFP的作用是
篩選
篩選
。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果預(yù)測(cè)和分析：
①轉(zhuǎn)基因里氏木霉菌無綠色熒光，說明PLC-E基因沉默，其機(jī)理是
在雙啟動(dòng)子作用下，轉(zhuǎn)錄形成的兩種RNA互補(bǔ)，產(chǎn)生雙鏈RNA，抑制翻譯，達(dá)到eGFP與PLC-E基因同時(shí)沉默的效果
在雙啟動(dòng)子作用下，轉(zhuǎn)錄形成的兩種RNA互補(bǔ)，產(chǎn)生雙鏈RNA，抑制翻譯，達(dá)到eGFP與PLC-E基因同時(shí)沉默的效果
。
②與野生型相比，轉(zhuǎn)基因里氏木霉菌的纖維二糖酶含量顯著降低，說明
磷脂酶促進(jìn)纖維二糖酶基因的表達(dá)
磷脂酶促進(jìn)纖維二糖酶基因的表達(dá)
。
