堿性蛋白酶廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療等行業(yè)。為了實(shí)現(xiàn)低成本高產(chǎn)量的目標(biāo)，研究人員通過誘變技術(shù)獲得高效分泌堿性蛋白酶的地衣芽孢桿菌，再利用基因工程手段將該地衣芽孢桿菌的堿性蛋白酶基因（Apr）導(dǎo)入大腸桿菌，構(gòu)建了表達(dá)胞外堿性蛋白酶的重組菌株。回答下列問題：
（1）在誘變技術(shù)處理的過程中，地衣芽孢桿菌發(fā)生了

基因突變

基因突變

（填“變異類型”）。由于該種變異具有

不定向性

不定向性

的特點(diǎn)，故誘變后還需經(jīng)過

篩選

篩選

才有可能獲得高效分泌堿性蛋白酶的芽孢桿菌。
（2）Apr基因兩端的核苷酸序列已知，如圖1所示。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增Apr基因所需要的引物是下列中的

AB

AB

。

A．5′-GGATCTAACGCGATACGC-3′
B．5′-CTCGAGCCGGAAATACTT-3′
C．5′-AAGTATTTCCGGCTCGAG-3′
D．5′-GCGTATCGCGTTAGATCC-3′
（3）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示，除目的基因條帶外，還有2條非特異條帶，可能的原因有：

①②

①②

（填序號(hào)），導(dǎo)致引物與模板中的非目的基因片段結(jié)合。
①引物序列較短
②引物和模板不完全配對(duì)
③復(fù)性溫度過高
（4）構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)需要的工具酶有

限制酶、DNA連接酶

限制酶、DNA連接酶

。如圖是2已構(gòu)建的重組表達(dá)載體pET-28b（+）-Apr示意圖，研究人員用XhoⅠ和NcoⅠ兩種酶（酶切位點(diǎn)見圖2，數(shù)字代表該位點(diǎn)與復(fù)制原點(diǎn)的距離）對(duì)重組菌株的DNA進(jìn)行雙酶切，若得到約為

1110

1110

bp和

5231

5231

bp的DNA片段，則初步表明目的基因已成功導(dǎo)入到大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)。