2.PHB2蛋白具有抑制細胞增殖的作用。為初步探究某動物PHB2蛋白抑制人宮頸癌細胞增殖的原因,研究者從基因數(shù)據(jù)庫中獲取了該蛋白的基因編碼序列(簡稱phb2基因),大小為0.9kb(1kb=1000堿基對),利用大腸桿菌表達該蛋白?;卮鹣铝袉栴}:
相關(guān)限制酶的識別序列及切割位點(注:箭頭表示切割位點)
名稱 |
識別序列及切割位點 |
名稱 |
識別序列及切割位點 |
HindⅢ |
A↓AGCTT TTCGA↑A |
EcoRⅠ |
G↓AATTCCTTAA↑G |
PvitⅡ |
CAG↓CTGGTC↑GAC |
PstⅠ |
CTGC↓AG GA↑CGTC |
KpnⅠ |
G↓GTACCCCATG↑G |
BamHⅠ |
G↓GATCCCCTAG↑G |
(1)圖1為所用載體圖譜示意圖,圖中限制酶的識別序列及切割位點見表。為使phb2基因(該基因序列不含圖1中限制酶的識別序列)與載體正確連接,在擴增的phb2基因兩端分別引入
和
兩種不同限制酶的識別序列。對于酶切的phb2基因和載體進行連接,選擇兩種限制酶切比用一種限制酶切好的原因:
。
注:M為指示分子大小的標準參照物;小于0.2kb的DNA分子條帶未出現(xiàn)在圖中
(2)將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌接種在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng),隨機挑取單菌落(分別編號為1、2、3、4)培養(yǎng)并提取質(zhì)粒,用(2)中選用的兩種限制酶進行酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳分離,結(jié)果如圖2,
號菌落的質(zhì)粒很可能是含目的基因的重組質(zhì)粒。
(3)根據(jù)PHB2cDNA的核苷酸序列設(shè)計了相應(yīng)的引物如圖,通過PCR擴增PHB2基因。已知A位點和B位點分別是起始密碼子和終止密碼子對應(yīng)的基因位置。選用的引物組合應(yīng)為
,pcr擴增時選取的DNA往往類似于圖,而目的基因往往只是其中的一個片段類似于AB段,當pcr擴增至第四輪循環(huán)時等長的目的基因片段占
。