心臟移植是挽救終末期心臟病患者生命唯一有效的手段，然而心臟移植過(guò)程中會(huì)發(fā)生缺血再灌注損傷（IRI），可能導(dǎo)致心臟壞死。研究發(fā)現(xiàn)，IRI通過(guò)促進(jìn)Caspase8等一系列凋亡基因的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡最終引起器官損傷。根據(jù)Caspase8基因合成的小干擾RNA（siRNA）可以使Caspase8基因沉默，有效抑制IRI所致的器官損傷。圖1是利用豬的心肌細(xì)胞開展siRNA作用研究的示意圖，圖2是此研究可能用到的4種限制酶及其切除位點(diǎn)?；卮鹣铝袉?wèn)題：

（1）圖1中步驟②構(gòu)建重組質(zhì)粒需要使用多種工具酶。常用的DNA連接酶有E.coliDNA連接酶和T₄DNA連接酶。圖2中

EcoRⅠ、PstⅠ

EcoRⅠ、PstⅠ

酶切割后的DNA片段可以用E.coliDNA連接酶連接，圖中

EcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRV

EcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRV

酶切割后的DNA片段可以用T₄DNA連接酶連接。DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學(xué)鍵是

磷酸二酯鍵

磷酸二酯鍵

。
（2）圖1中步驟③將重組質(zhì)粒導(dǎo)入豬的心肌細(xì)胞最常用的方法是

顯微注射法

顯微注射法

。siRNA對(duì)應(yīng)DNA序列在心肌細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生siRNA的步驟④稱為

轉(zhuǎn)錄

轉(zhuǎn)錄

。siRNA與RISC組裝形成基因沉默復(fù)合物，通過(guò)抑制基因表達(dá)的

翻譯

翻譯

過(guò)程，使Caspase8基因沉默，從而降低IRI引起的細(xì)胞凋亡。
（3）研究人員根據(jù)Caspase8基因的堿基序列，設(shè)計(jì)了三種序列分別導(dǎo)入豬的心肌細(xì)胞，通過(guò)測(cè)定靶基因Caspase8的mRNA含量來(lái)確定最優(yōu)序列。測(cè)定mRNA含量時(shí)，需提取心肌細(xì)胞的總RNA，經(jīng)過(guò)

逆轉(zhuǎn)錄

逆轉(zhuǎn)錄

過(guò)程得到cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)定PCR產(chǎn)物量，結(jié)果如圖3所示。據(jù)此判斷最優(yōu)序列是

序列2

序列2

。
（4）選用豬的心肌細(xì)胞作受體細(xì)胞是因?yàn)樨i在基因、解剖結(jié)構(gòu)、生理生化和免疫反應(yīng)等方面與人類極為相似。為了解決心臟移植供體短缺問(wèn)題，許多科學(xué)家正在研究用豬心臟代替人的心臟。你認(rèn)為將豬心臟移植到人體面臨的最大挑戰(zhàn)是

免疫排斥反應(yīng)

免疫排斥反應(yīng)

。