HSV1是單純皰疹病毒的一種類型，HSV1病毒顆粒的組裝主要由包裝信號(hào)序列（a′）介導(dǎo)。科研人員從HSV1基因組中分離出a′，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了質(zhì)粒pHSL并進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)（如圖1），從而為某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療提供依據(jù)。請(qǐng)回答問題：

（1）從HSV1中分離a′時(shí)，將人工合成的含特定序列的核酸探針與含有目的序列的酶解片段進(jìn)行

雜交

雜交

，根據(jù)陽性信號(hào)逐步篩選出盡可能短的a′所在片段。
（2）構(gòu)建質(zhì)粒pHSL時(shí)，過程②需要用限制酶

BamHⅠ和SalⅠ

BamHⅠ和SalⅠ

處理質(zhì)粒pHSV和質(zhì)粒pSK，處理后的產(chǎn)物經(jīng)鑒定、純化后用

DNA連接

DNA連接

酶連接。
（3）步驟③將質(zhì)粒pHSL導(dǎo)入大腸桿菌是因?yàn)橘|(zhì)粒pHSL中含有

大腸桿菌復(fù)制原點(diǎn)

大腸桿菌復(fù)制原點(diǎn)

，能在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)復(fù)制而獲得大量拷貝。
（4）Vero細(xì)胞系是從非洲綠猴的腎臟上皮細(xì)胞中分離培養(yǎng)出來的。進(jìn)行Vero細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，通常采用添加了

血清

血清

等天然成分的基本培養(yǎng)基提供營(yíng)養(yǎng)。
（5）tsK株是具有感染性的HSV1溫度敏感株。在tsK株的輔助下，pHSL能組裝成不含完整病毒基因組的顆粒（假病毒），獲得含假病毒和tsK株的混合毒株。圖2是Vero細(xì)胞連續(xù)傳代過程中，混合毒株的滴度變化曲線及每代中假病毒所占的比例（柱形圖）。據(jù)圖分析，應(yīng)選用

P6

P6

代混合毒株用于后續(xù)神經(jīng)細(xì)胞的接種實(shí)驗(yàn)，理由是

P6代混合病毒中tsK株滴度最低，假病毒顆粒的比例最高，盡量減少tsK株可能造成的細(xì)胞毒性

P6代混合病毒中tsK株滴度最低，假病毒顆粒的比例最高，盡量減少tsK株可能造成的細(xì)胞毒性

。
（6）為驗(yàn)證假病毒能否感染體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞并表達(dá)Laz基因，科研人員將混合毒株與大鼠神經(jīng)細(xì)胞按一定比例在

37

37

℃下混合培養(yǎng)48 h,用含

Xgal

Xgal

（填物質(zhì)名稱）的檢測(cè)液原位檢測(cè)β半乳糖苷酶的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大約20%的細(xì)胞變藍(lán)，說明

假病毒能感染神經(jīng)細(xì)胞，將外源基因Laz導(dǎo)入并表達(dá)

假病毒能感染神經(jīng)細(xì)胞，將外源基因Laz導(dǎo)入并表達(dá)

。