尖孢鐮刀菌會(huì)引起黃瓜枯萎病的發(fā)生。研究人員擬從土壤中分離篩選出對(duì)黃瓜枯萎病有抑制效果的拮抗細(xì)菌（jb9 菌株），以期為黃瓜枯萎病提供生物防治。實(shí)驗(yàn)過(guò)程如圖1所示，回答下列問題：

（1）將土壤樣品制成懸浮液，步驟Ⅰ使用的接種方法是

平板劃線法

平板劃線法

，純化培養(yǎng)的關(guān)鍵是

無(wú)菌操作

無(wú)菌操作

。培養(yǎng)基 a 必備的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有

碳源、氮源、水和無(wú)機(jī)鹽

碳源、氮源、水和無(wú)機(jī)鹽

。
（2）為驗(yàn)證jb9菌株的抑菌效果，需要先將尖孢鐮刀菌均勻地接種在培養(yǎng)基 b 表面，則接種方法是

稀釋涂布平板法

稀釋涂布平板法

。濾紙組作為對(duì)照組，用

無(wú)菌水

無(wú)菌水

處理濾紙。
（3）jb9菌株能合成分泌真菌細(xì)胞壁降解酶（HCD），抑制尖孢鐮刀菌（真菌）的生長(zhǎng)?？蒲腥藛T將獲取的HCD基因?qū)朦S瓜細(xì)胞，培育抗枯萎病的轉(zhuǎn)基因植株。含HCD基因的DNA片段、質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)及限制酶切割位點(diǎn)如圖2所示。
①根據(jù)題意，將HCD基因與圖示的質(zhì)粒重組，應(yīng)選用的限制酶是

BamHI和HindⅢ/HindⅢ和BamHI

BamHI和HindⅢ/HindⅢ和BamHI

。在篩選培養(yǎng)基上，要加入

氨芐青霉素

氨芐青霉素

來(lái)篩選含有HCD基因的受體細(xì)胞。將受體細(xì)胞培育后獲得轉(zhuǎn)基因植株。
②檢測(cè)HCD基因成功表達(dá)真菌細(xì)胞壁降解酶（HCD）的方法技術(shù)是

抗原—抗體雜交技術(shù)

抗原—抗體雜交技術(shù)

。
（4）為將pIgR基因以正確方向插入質(zhì)粒需要雙酶切，這就要求在設(shè)計(jì)引物時(shí)，需在引物的5'端加入相應(yīng)的酶切位點(diǎn)。已知a鏈為轉(zhuǎn)錄模板鏈，引物1的5'端酶切位點(diǎn)的堿基序列為GAATTC，則引物2的5'端酶切位點(diǎn)的堿基序列為

GCGGCCGC

GCGGCCGC

，理由是

a鏈為轉(zhuǎn)錄模板鏈，根據(jù)mRNA的合成方向，引物2的5'端靠近啟動(dòng)子，應(yīng)有NotⅠ的酶切位點(diǎn)

a鏈為轉(zhuǎn)錄模板鏈，根據(jù)mRNA的合成方向，引物2的5'端靠近啟動(dòng)子，應(yīng)有NotⅠ的酶切位點(diǎn)

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