酯酶結(jié)合熒光分析法可對有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥進行檢測，某研究院利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得一種催化效率高、農(nóng)藥敏感性強的微生物酯酶。

（1）人工合成酯酶基因后通過PCR技術(shù)可實現(xiàn)擴增，需要設(shè)計兩種引物，設(shè)計引物的作用是使DNA聚合酶能夠從引物的

3’端

3’端

開始連接脫氧核苷酸。為方便構(gòu)建重組質(zhì)粒，需要在引物的

5’

5’

端設(shè)計

限制性內(nèi)切核酸

限制性內(nèi)切核酸

酶的識別序列。某質(zhì)粒圖譜和目的基因的序列如上圖所示，應(yīng)選擇引物

①③

①③

（填數(shù)字）。（①-④中加粗表示識別序列前的保護堿基，增強上述酶與目的基因的結(jié)合）
①5’-CCGGAATTCATGCTTGATATGCCAATC-3’
②5’-CCCAAGCTTATGCTTGATATGCCAATC-3’
③5’-CCCAAGCTTCTAGTCGAACACAAGAAG-3’
④5’-CCGGAATTCCTAGTCGAACACAAGAAG-3’
（2）若提取高產(chǎn)酯酶野生菌的基因組DNA，用設(shè)計的引物和合適的條件進行PCR，其產(chǎn)物可用

（瓊脂糖凝膠）電泳

（瓊脂糖凝膠）電泳

鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有目的基因以外的雜交帶存在，分析可能原因是：

在基因組DNA中有其他引物結(jié)合的位點/引物特異性不強/引物過短

在基因組DNA中有其他引物結(jié)合的位點/引物特異性不強/引物過短

。解決措施：在目的基因的

上、下游

上、下游

（填“內(nèi)部”或“上、下游”）重新設(shè)計引物進行PCR。

限制酶	識別序列與切割位點	限制酶	識別序列與切割位點
PstⅠ	5’-CTGCA↓G-3’	NdeⅡ	5’-↓GATC-3’
HindⅢ	5’-A↓AGCTT-3’	EcoRⅠ	5’-G↓AATTC-3’
DpnⅡ	5’-↓GATC-3’	AluⅠ	5’-AG↓CT-3’

（3）將PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒用限制酶酶切，酶切產(chǎn)物純化后，用

DNA連接酶

DNA連接酶

連接，連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌前需用

Ca²⁺（氯化鈣溶液）

Ca²⁺（氯化鈣溶液）

處理大腸桿菌，使其處于感受態(tài)。