大麗輪枝菌（一種絲狀真菌）是引起棉花黃萎病的主要病原菌。為觀察大麗輪枝菌對(duì)棉花根侵染路徑，研究人員利用綠色熒光蛋白基因（sGFP）轉(zhuǎn)染大麗輪枝菌，培育出表達(dá)綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因菌株，主要過程如圖（圖中a鏈和 b鏈分別是相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄模板鏈）。分析回答：
（1）過程①中，PCR擴(kuò)增sGFP的原理是 DNA的半保留復(fù)制DNA的半保留復(fù)制，該過程除需要根據(jù) sGFP兩端（3′端）核苷酸序列sGFP兩端（3′端）核苷酸序列設(shè)計(jì)特異性引物序列外，為保證sCFP正確插入到質(zhì)粒中，還需要在引物的5′端添加限制酶識(shí)別序列，圖中b鏈的黏性末端堿基序列（5′→3′）為 AGCTAGCT。
（2）過程②需要的工具酶是 DNA連接酶DNA連接酶。研究中將sGFP插入到構(gòu)巢曲霉啟動(dòng)子和終止子之間的目的是 保證sGFP能在大麗輪枝菌細(xì)胞中表達(dá)保證sGFP能在大麗輪枝菌細(xì)胞中表達(dá)。
（3）過程③中需要配制細(xì)菌培養(yǎng)基，配制時(shí)要在培養(yǎng)基滅菌并冷卻到80℃左右后，再加入用無菌水配制的適宜濃度的潮霉素溶液，潮霉素不能與培養(yǎng)基一同滅菌的原因是 潮霉素在滅菌時(shí)結(jié)構(gòu)被破壞潮霉素在滅菌時(shí)結(jié)構(gòu)被破壞。
（4）選擇過程③篩選培養(yǎng)得到的不同農(nóng)桿菌菌落，分別提取細(xì)菌質(zhì)粒DNA，并用BamHI和HindⅢ完全酶切可得 兩兩種長(zhǎng)度不同的DNA片段。
（5）將導(dǎo)入重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌加入大麗輪枝菌的孢子細(xì)胞懸液中，在適宜條件完成轉(zhuǎn)染后利用濾膜過濾得到孢子細(xì)胞，再在真菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得菌落，最終通過檢測(cè) 大麗輪枝菌菌絲細(xì)胞中綠色熒光強(qiáng)度大麗輪枝菌菌絲細(xì)胞中綠色熒光強(qiáng)度篩選出綠色熒光蛋白旺盛表達(dá)的大麗輪枝菌。
【考點(diǎn)】基因工程的操作過程綜合．
【答案】DNA的半保留復(fù)制；sGFP兩端（3′端）核苷酸序列；AGCT；DNA連接酶；保證sGFP能在大麗輪枝菌細(xì)胞中表達(dá)；潮霉素在滅菌時(shí)結(jié)構(gòu)被破壞；兩；大麗輪枝菌菌絲細(xì)胞中綠色熒光強(qiáng)度
【解答】
【點(diǎn)評(píng)】
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發(fā)布：2024/6/27 10:35:59組卷：1引用：2難度：0.7
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（2）為確保目的基因定向插入了質(zhì)粒，應(yīng)該選擇（填酶）切割目的基因和質(zhì)粒。在培養(yǎng)基中加入（填“氨芐青霉素”或“四環(huán)素”）對(duì)目的基因進(jìn)行篩選。
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發(fā)布：2024/12/20 3:30:1組卷：6引用：1難度：0.6
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