新冠病毒在人體細胞表面蛋白受體由ACE2控制表達,該基因的開放閱讀框(mRNA 從起始密碼子到終止密碼子之間的核苷酸序列)cDNA序列大小為2418bp(bp表示堿基對),在280bp和1070bp位點分別有一個HindⅢ和Xho I酶切位點(圖1)。甲、乙兩位同學通過分子生物學方法克隆該基因到 pMD18-T載體(圖2)中,各自的測序結果如圖4,并進一步通過雙酶切獲得ACE2基因編碼序列與pEGFP-N1(圖2)載體重組(MCS多酶切位點序列如圖3所示)并表達。試分析回答下列問題:
(1)根據(jù)圖2可知,兩種載體都具有的基本結構有
復制原點
復制原點
和 標記基因
標記基因
限制酶切割位點。
(2)ACE2基因與pMD18-T載體構建的重組質粒經(jīng)轉化后細胞需要在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中篩選的原因是 載體上含有氨芐青霉素抗性基因Ampr
載體上含有氨芐青霉素抗性基因Ampr
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(3)甲、乙兩位同學均得到ACE2基因的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體的重組質粒,針對ACE2基因的部分測序結果如圖4,并進一步利用圖4中標記的限制酶進行雙酶切,獲得ACE2基因編碼序列,同時用相同限制酶酶切 pEGFP-N1載體,然后構建重組質粒。兩位同學對獲得的重組質粒進行酶切檢測:①甲同學只得到空載體;②乙同學在重組質粒中檢測到了1348 bp 部分目的基因片段。請對該實驗結果進行分析:
①甲同學用BglⅡ和BamHⅠ兩種限制酶酶切ACE2與pMD18-T載體構建的重組質粒后,5’端均突出—GATC,產(chǎn)生相同的黏性末端,載體pEGFP-N1用BglⅡ和BamHⅠ兩種限制酶雙酶切后,可以自連,很難在連接體系中與其他DNA片段形成重組質粒
甲同學用BglⅡ和BamHⅠ兩種限制酶酶切ACE2與pMD18-T載體構建的重組質粒后,5’端均突出—GATC,產(chǎn)生相同的黏性末端,載體pEGFP-N1用BglⅡ和BamHⅠ兩種限制酶雙酶切后,可以自連,很難在連接體系中與其他DNA片段形成重組質粒
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②乙同學用XhoⅠ和BamHⅠ兩種限制酶酶切ACE2與pMD18-T載體構建的重組質粒。已知ACE2基因編碼序列含有2418bp,ACE2基因在開放閱讀框1070bp處還有一個XhoⅠ酶切位點,酶切后便可以得到一個1348bp(2418—1070=1348)的大片段與載體pEGFP-N1雙酶切后的大片段連接構建重組質粒
乙同學用XhoⅠ和BamHⅠ兩種限制酶酶切ACE2與pMD18-T載體構建的重組質粒。已知ACE2基因編碼序列含有2418bp,ACE2基因在開放閱讀框1070bp處還有一個XhoⅠ酶切位點,酶切后便可以得到一個1348bp(2418—1070=1348)的大片段與載體pEGFP-N1雙酶切后的大片段連接構建重組質粒
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