PCR定點(diǎn)突變技術(shù)是最常用的基因突變技術(shù)，通過定點(diǎn)誘變可以在體外改造DNA分子。重疊延伸PCR是發(fā)展最早的PCR定點(diǎn)突變技術(shù)，操作過程如圖1?？赏ㄟ^測(cè)序檢驗(yàn)定點(diǎn)突變是否成功?，F(xiàn)欲將改造后的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌，質(zhì)粒結(jié)構(gòu)如圖2?；卮鹣铝袉栴}：
（1）圖1所示重疊延伸PCR中，第1對(duì)引物是
突變引物FP2和通用引物RP2
突變引物FP2和通用引物RP2
；在第1對(duì)引物組成的反應(yīng)系統(tǒng)和第2對(duì)引物組成的反應(yīng)系統(tǒng)中各進(jìn)行一次復(fù)制，共產(chǎn)生 3
3
種DNA分子；此過程不能將兩對(duì)引物共置于同一反應(yīng)系統(tǒng)中，原因是 突變引物FP2和突變引物RP1可以互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)致引物失效
突變引物FP2和突變引物RP1可以互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)致引物失效
。
（2）圖1所示DNA分子不能延伸，原因是 DNA單鏈延伸的方向必須是5’到3’
DNA單鏈延伸的方向必須是5’到3’
。
（3）分析圖1和圖2，要將突變的基因定向插入質(zhì)粒并構(gòu)建表達(dá)載體，應(yīng)如何設(shè)計(jì)通用引物FP1和通用引物RP2？應(yīng)保證突變基因右側(cè)應(yīng)是CTAG
應(yīng)保證突變基因右側(cè)應(yīng)是CTAG
。
（4）為篩選出含有目的基因的大腸桿菌，通常采用影印法（使用無菌的絨氈布?jí)涸谂囵B(yǎng)基A的菌落上，帶出少許菌種，平移并壓在培養(yǎng)基B上，結(jié)果如圖3）。培養(yǎng)基A中應(yīng)添加 氨芐青霉素
氨芐青霉素
，培養(yǎng)基B中應(yīng)添加 四環(huán)素
四環(huán)素
，含有重組質(zhì)粒的菌落是 4、6
4、6
（填寫數(shù)字），原因是 用兩種限制酶對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行切割時(shí)，會(huì)破壞四環(huán)素抗性基因，但不會(huì)破壞氨芐青霉素抗性基因，因此導(dǎo)入重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌能在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上能生存，但不能在含有四環(huán)素培養(yǎng)基上生存
用兩種限制酶對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行切割時(shí)，會(huì)破壞四環(huán)素抗性基因，但不會(huì)破壞氨芐青霉素抗性基因，因此導(dǎo)入重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌能在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上能生存，但不能在含有四環(huán)素培養(yǎng)基上生存
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