科學(xué)家應(yīng)用抗旱基因培育出了耐旱玉米新品系，為解決我國(guó)糧食問(wèn)題做出了重要貢獻(xiàn)。若測(cè)得某耐旱基因（mt1D）編碼鏈?zhǔn)锥说侥┒耍ㄆ渲幸粭l鏈）的序列為5'-ATCTACGCGCTCATCCG …（省略3n個(gè)核苷酸序列）……CGCAGCAATGAGTAGCG-3'。如圖1為構(gòu)建重組質(zhì)粒的過(guò)程示意圖，BamHⅠ、BclⅠ、SmaⅠ、Sau3AⅠ為限制酶（四種酶的識(shí)別序列詳見表），箭頭表示轉(zhuǎn)錄方向?；卮鹣铝袉?wèn)題：

限制酶	BamHⅠ	BclⅠ	SmaⅠ	Sau3AⅠ
識(shí)別序列及切割位點(diǎn)（5′→3′）	G↓GATCC	T↓GATCA	CCC↓GGG	↓GATC

?
（1）為獲取更多mtlD基因，可采用PCR技術(shù)擴(kuò)增，在反應(yīng)體系中除加入引物、dNTP、緩沖液、Mg²⁺外，還需要加入

模板、耐高溫的DNA聚合酶

模板、耐高溫的DNA聚合酶

。某同學(xué)設(shè)計(jì)了如下六種PCR引物，其中適合選用的一對(duì)引物是

②④

②④

（選填序號(hào)）。
①5′-GACTACTCGCGCATCTA-3′
②5′-ATCTACGCGCTCATCCG-3′
③5′-GCGATGAGTAACGACGC-3′
④5′-CGCTACTCATTGCTGCG-3′
⑤5′-TAGATGCGCGAGTAGGC-3′
⑥5′-CGCAGCAATGAGTAGCG-3′
（2）若PCR反應(yīng)得到的非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物偏多，從引物設(shè)計(jì)和溫度控制角度考慮，主要原因可能是

退火溫度低，引物設(shè)計(jì)不恰當(dāng)

退火溫度低，引物設(shè)計(jì)不恰當(dāng)

。
（3）為將圖中質(zhì)粒A和mtlD基因正確連接構(gòu)建重組質(zhì)粒B，設(shè)計(jì)mtlD基因的引物時(shí)，在兩種引物的5′端分別添加

BamHⅠ、SmaⅠ

BamHⅠ、SmaⅠ

限制酶的識(shí)別序列，選用

BclⅠ、SmaⅠ

BclⅠ、SmaⅠ

限制酶切割質(zhì)粒A，酶切后的載體和目的基因片段通過(guò)

T₄DNA連接

T₄DNA連接

酶作用后獲得重組質(zhì)粒。為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞，應(yīng)首先在篩選平板培養(yǎng)基添加

四環(huán)素

四環(huán)素

，再將平板上長(zhǎng)出的菌落通過(guò)影印平板法接種到添加

氨芐青霉素

氨芐青霉素

的平板培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)觀察。
（4）若從平板上長(zhǎng)出的菌落中提取重組質(zhì)粒B利用Sau3AⅠ進(jìn)行完全酶切，最多可以得到

3

3

種大小不同的DNA片段。
（5）圖2是對(duì)重組質(zhì)粒測(cè)序的部分序列，若目的基因與質(zhì)粒正確連接，則圖中M連接處的序列正確的是

Q3

Q3

，填序列編號(hào)）。