微生物農藥是指以細菌、真菌、病毒和原生動物或經基因修飾的微生物活體為有效成分，防治病、蟲、草、鼠等有害生物的生物源農藥。研究發(fā)現(xiàn)，蘿卜抗真菌蛋白（RS-AFPs）由RS-AFP2基因序列控制合成，是一類富含半胱氨酸的堿性蛋白質，具有抗絲狀真菌活性，是天然免疫體系中的重要效應分子。蘿卜抗真菌蛋白能夠保護種子的正常萌發(fā)以及保護植物組織免受病原菌的危害而且對人體沒有影響。我國科學家欲獲得高效表達RS-AFPs的轉基因大腸桿菌作為微生物農藥，相關研究如圖。
（1）科學家用

限制性內切核酸酶和DNA連接酶

限制性內切核酸酶和DNA連接酶

處理RS-AFPs基因和質粒以獲得重組質粒，再將重組質粒置于

Ca²⁺

Ca²⁺

處理的大腸桿菌細胞懸液中，該處理的作用是

使大腸桿菌細胞處于感受態(tài)，便于重組質粒的導入

使大腸桿菌細胞處于感受態(tài)，便于重組質粒的導入

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（2）檢測發(fā)現(xiàn)，轉入的RS-AFPs基因在大腸桿菌細胞中表達效率很低。研究者推測不同生物對密碼子具有不同的偏好，因而設計了與RS-AFPs基因結合的兩對引物（引物B和C中都替換了一個堿基）如圖1所示，并按如圖2方式依次進行4次PCR擴增，已得到新的RS-AFPs基因。這種定點的基因突變技術在圖2所示的4次PCR應該分別如何選擇下表所示的引物？請?zhí)顚懸幌卤砀瘢ㄈ暨x用該引物畫“Ο”，若不選用該引物則不做標記）。

	引物A	引物B	引物C	引物D
PCR1	Ο Ο	Ο Ο
PCR2			Ο Ο	Ο Ο
PCR4	Ο Ο			Ο Ο

（3）研究者進一步將含有新的RS-AFP2基因的重組質粒和含有RS-AFP2基因的重組質粒以及

空質粒

空質粒

分別導入大腸桿菌。提取培養(yǎng)液中的蛋白質，用

抗原—抗體雜交

抗原—抗體雜交

方法檢測并對結果進行比較，從而判斷新的RS-AFP2基因表達效率是否提高；為檢測表達產物的生物活性，研究者將上述各組表的產物加入長滿了植物病菌的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一段時間后，比較

抑菌圈

抑菌圈

的大小，以確定表達產物的生物活性大小。以上兩種方法是從

分子和個體

分子和個體

水平上對轉基因大腸桿菌進行檢測和鑒定。
（4）作為微生物農藥，與使用傳統(tǒng)的化學農藥相比，其優(yōu)點是

對人畜安全、不污染環(huán)境等

對人畜安全、不污染環(huán)境等

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