微生物農(nóng)藥是指以細(xì)菌、真菌、病毒和原生動物或經(jīng)基因修飾的微生物活體為有效成分，防治病、蟲、草、鼠等有害生物的生物源農(nóng)藥。研究發(fā)現(xiàn)，蘿卜抗真菌蛋白（RS-AFPs）由RS-AFP2基因序列控制合成，是一類富含半胱氨酸的堿性蛋白質(zhì)，具有抗絲狀真菌活性，是天然免疫體系中的重要效應(yīng)分子。蘿卜抗真菌蛋白能夠保護(hù)種子的正常萌發(fā)以及保護(hù)植物組織免受病原菌的危害而且對人體沒有影響。我國科學(xué)家欲獲得高效表達(dá)RS-AFPs的轉(zhuǎn)基因大腸桿菌作為微生物農(nóng)藥，相關(guān)研究如圖。
（1）科學(xué)家用

限制性內(nèi)切核酸酶和DNA連接酶

限制性內(nèi)切核酸酶和DNA連接酶

處理RS-AFPs基因和質(zhì)粒以獲得重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒置于

Ca²⁺

Ca²⁺

處理的大腸桿菌細(xì)胞懸液中，該處理的作用是

使大腸桿菌細(xì)胞處于感受態(tài)，便于重組質(zhì)粒的導(dǎo)入

使大腸桿菌細(xì)胞處于感受態(tài)，便于重組質(zhì)粒的導(dǎo)入

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（2）檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)入的RS-AFPs基因在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)效率很低。研究者推測不同生物對密碼子具有不同的偏好，因而設(shè)計了與RS-AFPs基因結(jié)合的兩對引物（引物B和C中都替換了一個堿基）如圖1所示，并按如圖2方式依次進(jìn)行4次PCR擴(kuò)增，已得到新的RS-AFPs基因。這種定點的基因突變技術(shù)在圖2所示的4次PCR應(yīng)該分別如何選擇下表所示的引物？請?zhí)顚懸幌卤砀瘢ㄈ暨x用該引物畫“Ο”，若不選用該引物則不做標(biāo)記）。

	引物A	引物B	引物C	引物D
PCR1	Ο Ο	Ο Ο
PCR2			Ο Ο	Ο Ο
PCR4	Ο Ο			Ο Ο

（3）研究者進(jìn)一步將含有新的RS-AFP2基因的重組質(zhì)粒和含有RS-AFP2基因的重組質(zhì)粒以及

空質(zhì)粒

空質(zhì)粒

分別導(dǎo)入大腸桿菌。提取培養(yǎng)液中的蛋白質(zhì)，用

抗原—抗體雜交

抗原—抗體雜交

方法檢測并對結(jié)果進(jìn)行比較，從而判斷新的RS-AFP2基因表達(dá)效率是否提高；為檢測表達(dá)產(chǎn)物的生物活性，研究者將上述各組表的產(chǎn)物加入長滿了植物病菌的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一段時間后，比較

抑菌圈

抑菌圈

的大小，以確定表達(dá)產(chǎn)物的生物活性大小。以上兩種方法是從

分子和個體

分子和個體

水平上對轉(zhuǎn)基因大腸桿菌進(jìn)行檢測和鑒定。
（4）作為微生物農(nóng)藥，與使用傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥相比，其優(yōu)點是

對人畜安全、不污染環(huán)境等

對人畜安全、不污染環(huán)境等

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