CRISPR/Cas9系統(tǒng)可對(duì)基因組進(jìn)行定點(diǎn)編輯，其工作原理如圖1所示。該系統(tǒng)主要包含單鏈向?qū)NA和Cas9酶兩個(gè)部分，能特異性識(shí)別并結(jié)合特定的DNA序列，從而引導(dǎo)Cas9酶到相應(yīng)位置并剪切DNA，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因序列的編輯。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：

（1）圖1為CRISPR/Cas9系統(tǒng)作用示意圖，該系統(tǒng)能精準(zhǔn)識(shí)別相關(guān)基因的原理是sgRNA與目標(biāo)DNA發(fā)生

堿基互補(bǔ)配對(duì)

堿基互補(bǔ)配對(duì)

，Cas9酶可催化

磷酸二酯鍵

磷酸二酯鍵

（化學(xué)鍵名稱(chēng)）水解，剪切特定DNA片段。
（2）LMNA基因編碼的核纖層蛋白與維持細(xì)胞核正常形態(tài)有關(guān)?？蒲腥藛T利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)體外培養(yǎng)的HepG2（人源肺癌細(xì)胞）細(xì)胞株進(jìn)行基因編輯，獲得了LMNA基因敲除的穩(wěn)定細(xì)胞系。
①體外培養(yǎng)的HepG2時(shí)需要一定比例的O₂和CO₂，其中CO₂的主要作用是

維持培養(yǎng)液pH值

維持培養(yǎng)液pH值

；培養(yǎng)基除滅菌外還需要通過(guò)

定期更換培養(yǎng)液（添加一定量的抗生素/無(wú)菌操作）

定期更換培養(yǎng)液（添加一定量的抗生素/無(wú)菌操作）

來(lái)保證無(wú)菌無(wú)毒環(huán)境。
②HepG2細(xì)胞中沒(méi)有編碼Cas9的基因，需將Cas9基因及sgRNA基因拼接形成拼接基因并與質(zhì)粒結(jié)合導(dǎo)入HepG2細(xì)胞，用圖2中的質(zhì)粒以及含Cas9-sgRNA拼接基因的DNA片段構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，應(yīng)選用

EcoRI

EcoRI

進(jìn)行酶切。
③將構(gòu)建好的表達(dá)載體與用

Ca²⁺（CaCl₂）

Ca²⁺（CaCl₂）

處理的細(xì)菌置于適宜反應(yīng)體系中培養(yǎng)。然后將培養(yǎng)的細(xì)菌涂布于含

嘌呤霉素

嘌呤霉素

的平板培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)，24h后挑取菌落，提取質(zhì)粒作為模板，選擇圖3中引物組合

Ⅱ

Ⅱ

和

Ⅲ

Ⅲ

，通過(guò)PCR和電泳技術(shù)鑒定是否重組成功。
④用鑒定成功的工程菌對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)三天后收集HepG2細(xì)胞，提取基因組，對(duì)其

堿基/核苷酸

堿基/核苷酸

序列進(jìn)行檢測(cè)，判斷Cas9-sgRNA拼接基因是否導(dǎo)入成功。若從細(xì)胞水平進(jìn)行檢測(cè)，可以檢測(cè)HepG2細(xì)胞數(shù)目增長(zhǎng)量或

細(xì)胞核形態(tài)

細(xì)胞核形態(tài)

。