重組工程是一項新型的基因操作技術(shù)，其基本原理是通過重組酶將特定的單鏈DNA片段與雙鏈DNA分子在同源序列處重組，從而實現(xiàn)基因的敲除、替換和突變等修飾。圖1表示DNA單鏈重組過程示意圖，請回答問題：

（1）基因工程的核心是在體外構(gòu)建

基因表達載體

基因表達載體

，該過程中使用的酶是

限制酶和DNA連接

限制酶和DNA連接

。
（2）圖2是大腸桿菌pBR322-Red質(zhì)粒的示意圖?？蒲腥藛T欲利用重組工程技術(shù)敲除該質(zhì)粒上從kil基因至N基因之間的DNA序列，設(shè)計的單鏈多核苷酸引物應(yīng)為

①、④

①、④

的連接序列（在①、②、③、④中選填）。

（3）將單鏈多核苷酸與含有pBR322-Red質(zhì)粒的大腸桿菌感受態(tài)細胞混合、電擊轉(zhuǎn)化，在重組酶的作用下，理論上1%～6%的大腸桿菌會發(fā)生體內(nèi)同源重組。已知線性化質(zhì)粒無法轉(zhuǎn)化大腸桿菌。為了從大腸桿菌混合物中篩選出發(fā)生重組的克隆，科研人員進行了下列操作。請完成表格相關(guān)內(nèi)容。

目的	簡要操作
擴大培養(yǎng)	①將大腸桿菌混合物全部轉(zhuǎn)入含 氨芐青霉素 氨芐青霉素 的液體培養(yǎng)基中
質(zhì)粒提取、酶切	②提取質(zhì)粒，選擇限制酶 XhoXhoⅠ XhoXhoⅠ 進行處理
轉(zhuǎn)化	③用酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 不含 不含 （“含有”或“不含有”）pBR322-Red質(zhì)粒大腸桿菌的感受態(tài)細胞
鑒定、篩選	④菌落PCR技術(shù)、瓊脂糖凝膠電泳

（4）圖3為用瓊脂糖凝膠電泳鑒定的結(jié)果，其中泳道

1

1

（填“1”或“2”）對應(yīng)的是kil-N基因缺失的質(zhì)粒。

（5）常規(guī)的基因工程和重組工程都能將外源基因插入質(zhì)粒。一般情況下，限制酶在質(zhì)粒上存在多個作用位點，因此常規(guī)的基因工程技術(shù)構(gòu)建重組質(zhì)粒時會出現(xiàn)

目的基因插入位置不準確

目的基因插入位置不準確

現(xiàn)象，而重組工程技術(shù)可以提高精準度。