In-Fusion技術(shù)是一項(xiàng)新型的無(wú)縫克隆技術(shù)。該技術(shù)關(guān)鍵是要在目的基因兩端構(gòu)建與線性化質(zhì)粒末端相同的DNA序列（即同源序列，通常為15～20bp），然后用In-Fusion酶處理即可實(shí)現(xiàn)無(wú)縫連接。它的操作步驟大致為：①質(zhì)粒線性化；②PCR擴(kuò)增出兩端含線性化質(zhì)粒同源序列的目的基因；③目的基因與線性化質(zhì)粒同源區(qū)域在In-Fusion酶的作用下形成重組質(zhì)粒；④將重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞。

（1）過(guò)程①中需要用到的酶是

TaqDNA聚合酶

TaqDNA聚合酶

。另外，利用

限制酶

限制酶

處理也可以直接得到線性化質(zhì)粒。
（2）據(jù)圖分析，為保證擴(kuò)增出所需的目的基因，引物A或引物B要依據(jù)

目的基因和質(zhì)粒

目的基因和質(zhì)粒

的堿基序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。過(guò)程②經(jīng)過(guò)

3

3

輪循環(huán)即可初步得到符合要求的目的基因片段。
（3）過(guò)程③中，同源序列1、2的堿基排序不同，這樣設(shè)計(jì)的好處是

防止目的基因反向連接；防止線性化質(zhì)?；蚰康幕虻淖陨憝h(huán)化

防止目的基因反向連接；防止線性化質(zhì)?；蚰康幕虻淖陨憝h(huán)化

。圖示In-Fusion技術(shù)可作為模型使用，一般來(lái)說(shuō)只需要改變圖中的

引物A和引物B

引物A和引物B

，即可快速構(gòu)建出另一種目的基因的重組質(zhì)粒。
（4）若目的基因是氨芐青霉素抗性基因，以大腸桿菌作為受體細(xì)胞。為檢測(cè)已轉(zhuǎn)化大腸桿菌的抗性效果，在含氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間后，用顯微鏡計(jì)數(shù)法或

稀釋涂布平板

稀釋涂布平板

法進(jìn)行計(jì)數(shù)，若計(jì)數(shù)結(jié)果分別是M、N，則致死率可用（M-N）/M×100%表示，通過(guò)后者來(lái)計(jì)數(shù)，此結(jié)果較真實(shí)值偏大，原因是

在用稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)時(shí)，當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，在平板上觀察到的是一個(gè)菌落

在用稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)時(shí)，當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，在平板上觀察到的是一個(gè)菌落

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