In-Fusion技術(shù)是一項新型的無縫克隆技術(shù)。該技術(shù)關(guān)鍵是要在目的基因兩端構(gòu)建與線性化質(zhì)粒末端相同的DNA序列(即同源序列,通常為15~20bp),然后用In-Fusion酶處理即可實現(xiàn)無縫連接。它的操作步驟大致為:①質(zhì)粒線性化;②PCR擴(kuò)增出兩端含線性化質(zhì)粒同源序列的目的基因;③目的基因與線性化質(zhì)粒同源區(qū)域在In-Fusion酶的作用下形成重組質(zhì)粒;④將重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞。
(1)過程①中需要用到的酶是 TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶。另外,利用 限制酶限制酶處理也可以直接得到線性化質(zhì)粒。
(2)據(jù)圖分析,為保證擴(kuò)增出所需的目的基因,引物A或引物B要依據(jù) 目的基因和質(zhì)粒目的基因和質(zhì)粒的堿基序列進(jìn)行設(shè)計。過程②經(jīng)過 33輪循環(huán)即可初步得到符合要求的目的基因片段。
(3)過程③中,同源序列1、2的堿基排序不同,這樣設(shè)計的好處是 防止目的基因反向連接;防止線性化質(zhì)粒或目的基因的自身環(huán)化防止目的基因反向連接;防止線性化質(zhì)?;蚰康幕虻淖陨憝h(huán)化。圖示In-Fusion技術(shù)可作為模型使用,一般來說只需要改變圖中的 引物A和引物B引物A和引物B,即可快速構(gòu)建出另一種目的基因的重組質(zhì)粒。
(4)若目的基因是氨芐青霉素抗性基因,以大腸桿菌作為受體細(xì)胞。為檢測已轉(zhuǎn)化大腸桿菌的抗性效果,在含氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間后,用顯微鏡計數(shù)法或 稀釋涂布平板稀釋涂布平板法進(jìn)行計數(shù),若計數(shù)結(jié)果分別是M、N,則致死率可用(M-N)/M×100%表示,通過后者來計數(shù),此結(jié)果較真實值偏大,原因是 在用稀釋涂布平板法計數(shù)時,當(dāng)兩個或多個細(xì)胞連在一起時,在平板上觀察到的是一個菌落在用稀釋涂布平板法計數(shù)時,當(dāng)兩個或多個細(xì)胞連在一起時,在平板上觀察到的是一個菌落。
【答案】TaqDNA聚合酶;限制酶;目的基因和質(zhì)粒;3;防止目的基因反向連接;防止線性化質(zhì)?;蚰康幕虻淖陨憝h(huán)化;引物A和引物B;稀釋涂布平板;在用稀釋涂布平板法計數(shù)時,當(dāng)兩個或多個細(xì)胞連在一起時,在平板上觀察到的是一個菌落
【解答】
【點評】
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發(fā)布:2024/6/27 10:35:59組卷:17引用:2難度:0.5
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