已知組成型啟動子可以高效地啟動目的基因在植物各種組織中的表達(dá)，但常會阻礙植物的生長發(fā)育。誘導(dǎo)型啟動子可在特定環(huán)境條件下誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)。沙冬青脫水素基因（AmDHN基因）能使植株具有較強(qiáng)的抗旱作用。科研人員通過構(gòu)建AmDHN基因表達(dá)載體，以培育耐旱苜蓿新品種，所用載體如圖1所示，請回答下列問題：

限制酶	Be1Ⅰ	SacⅠ	BamHⅠ	PstⅠ	SmaⅠ
識別序列和酶切位點(diǎn)	T↓GATCA	GAGCT↓C	G↓GATCC	CTGCA↓G	CCC↓GGG

（1）用載體1構(gòu)建含AmDHN目的基因的表達(dá)載體，可以成功轉(zhuǎn)化苜蓿，但會出現(xiàn)抑制抗性芽生長和抗性植株生根的現(xiàn)象，推測³⁵S啟動子屬于

組成型

組成型

啟動子。
（2）如表是科研人員擴(kuò)增Rd29A啟動子所設(shè)計(jì)的引物，根據(jù)引物的堿基序列及限制酶的識別序列分析，構(gòu)建載體2時選用的限制酶是

SacⅠ和SmaⅠ

SacⅠ和SmaⅠ

。為了改造載體1中的啟動子，需要用

BclⅠ和SacⅠ

BclⅠ和SacⅠ

酶切割載體1、2為最佳。

上游引物P1：5'-GACCCGGGTTTCCAAAGATTTTTTTC-3' 下游引物P2：5'-GAGAGCTCTGGGGTTTTGCTTTTGAATGT-3'

（3）構(gòu)建Rd29A啟動子驅(qū)動AmDHN基因的表達(dá)載體后，先將其導(dǎo)入

農(nóng)桿菌

農(nóng)桿菌

，再轉(zhuǎn)化苜蓿。轉(zhuǎn)化后應(yīng)在培養(yǎng)基中添加

新霉素

新霉素

進(jìn)行篩選。
（4）為檢測轉(zhuǎn)基因苜蓿中AmDHN基因的表達(dá)水平，科研人員做了相關(guān)實(shí)驗(yàn)。如表呈現(xiàn)了部分操作步驟，請完成表格：

實(shí)驗(yàn)步驟的目的	簡要操作過程
① 使幼苗適應(yīng)外界的自然環(huán)境（進(jìn)行煉苗）材料處理 使幼苗適應(yīng)外界的自然環(huán)境（進(jìn)行煉苗）材料處理	在轉(zhuǎn)基因無菌苗根系長至 2～3 cm 時，將培養(yǎng)無菌苗三角瓶的封口膜打開，培養(yǎng)一周，觀察其生長狀況
提供適宜生長條件	將甲組幼苗根系置于300mL水中
模擬干旱脅迫條件	② 將乙組幼苗根系置于等量的20%PEG溶液中 將乙組幼苗根系置于等量的20%PEG溶液中
無關(guān)變量控制	將甲、乙兩組置于溫度、光照等條件適宜且相同的環(huán)境中培養(yǎng)8h,之后剪取兩組葉片放在液氮中儲存
③ 檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量，估算目的基因的表達(dá)量 檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量，估算目的基因的表達(dá)量	對葉片研磨、離心后，提取④ （總）RNA （總）RNA ，以AmDHN和MtActin基因⑤ 兩端脫氧核苷酸序列 兩端脫氧核苷酸序列 為依據(jù)設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，其中MtActin（一種細(xì)胞骨架蛋白）為內(nèi)參。擴(kuò)增產(chǎn)物用⑥ 瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖凝膠電泳 檢測，EB（溴化乙錠）染色照相如圖。