重組工程是一項新型的基因操作技術，其基本原理是通過重組酶將特定的單鏈DNA片段與雙鏈DNA分子在同源序列處重組，從而實現(xiàn)基因的敲除、替換和突變等修飾。圖1表示DNA單鏈重組過程示意圖，請回答問題：

（1）基因工程的核心工作是

構建基因表達載體

構建基因表達載體

。
（2）圖2是大腸桿菌pBR322-Red質(zhì)粒的示意圖?？蒲腥藛T欲利用重組工程技術敲除該質(zhì)粒上從ki1基因至N基因之間的DNA序列，設計的單鏈多核苷酸引物應為

①、④

①、④

的連接序列（在①、②、③、④中選填）。
（3）將單鏈多核苷酸與含有pBR322-Red質(zhì)粒的大腸桿菌感受態(tài)細胞混合、電擊轉化，在重組酶的作用下，理論上1%～6%的大腸桿菌會發(fā)生體內(nèi)同源重組。已知線性化質(zhì)粒無法轉化大腸桿菌。為了從大腸桿菌混合物中篩選出發(fā)生重組的克隆，科研人員進行了下列操作。請完成表格相關內(nèi)容。

目的	簡要操作
擴大培養(yǎng)	①將大腸桿菌混合物全部轉入含 氨芐青霉素 氨芐青霉素 的液體培養(yǎng)基中
質(zhì)粒提取、酶切	②提取質(zhì)粒，選擇限制酶 XhoⅠ XhoⅠ 進行處理
轉化	③用酶切產(chǎn)物轉化 不含有 不含有 （“含有”或“不含有”）pBR322-Red質(zhì)粒大腸桿菌的感受態(tài)細胞
鑒定、篩選	④菌落PCR技術、瓊脂糖凝膠電泳

（4）PCR技術擴增目的基因的前提是

已知一段目的基因的核苷酸序列

已知一段目的基因的核苷酸序列

，以便根據(jù)此前提合成引物。引物的作用是

使Taq酶能從引物的3'端連接脫氧核苷酸

使Taq酶能從引物的3'端連接脫氧核苷酸

。
圖3為用瓊脂糖凝膠電泳對PCR結果進行鑒定，其中泳道

1

1

（填“1”或“2”）對應的是ki1-N基因缺失的質(zhì)粒。在電泳過程中，為了指示電泳進程，可以將PCR擴增產(chǎn)物與

熒光標記物

熒光標記物

混合。
（5）常規(guī)的基因工程和重組工程都能將外源基因插入質(zhì)粒。一般情況下，限制酶在質(zhì)粒上存在多個作用位點，因此常規(guī)的基因工程技術構建重組質(zhì)粒時會出現(xiàn)

目的基因插入位置不準確

目的基因插入位置不準確

現(xiàn)象，而重組工程技術可以提高精準。