野生型黑麥草細(xì)胞壁中較高的木質(zhì)素含量會降低其作為青儲飼料的品質(zhì)。D蛋白是催化木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶，某研究小組通過構(gòu)建含D基因部分序列正、反向片段的表達(dá)干擾載體（如圖所示），在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生雙鏈RNA分子，誘導(dǎo)D基因的mRNA持續(xù)降解，培育得到低木質(zhì)素含量的黑麥草。

（1）D基因的正、反向目的片段的克?。禾崛∫吧秃邴湶萑~片全部mRNA，

逆轉(zhuǎn)錄

逆轉(zhuǎn)錄

成cDNA。根據(jù)cDNA序列選取合適的片段，分別設(shè)計正、反向目的片段的上下游引物，正向片段和反向片段引物的擴(kuò)增序列

相同

相同

（相同/不同），酶切位點

不同

不同

（相同/不同），以使目的片段定向插入載體的特定位置。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)

瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖凝膠電泳

，切下目的條帶回收后與載體連接，形成克隆載體以用于正、反目的片段的擴(kuò)增。
（2）構(gòu)建D基因的表達(dá)干擾載體：
Ⅰ．對含有正向片段的克隆載體和反向片段的克隆載體分別進(jìn)行雙酶切，將回收片段與經(jīng)相同酶切的中間載體用

DNA連接酶

DNA連接酶

酶進(jìn)行連接，獲得含有干擾片段的重組中間載體；為使干擾片段能在受體細(xì)胞中復(fù)制，中間載體需有

復(fù)制起點

復(fù)制起點

。
Ⅱ．將干擾片段和超表達(dá)啟動子插入Ti質(zhì)粒的

T-DNA

T-DNA

得到D基因的表達(dá)干擾載體，插入超表達(dá)啟動子的目的是

促進(jìn)正、反向目的片段（干擾片段）的轉(zhuǎn)錄，得到足量的相應(yīng)RNA分子

促進(jìn)正、反向目的片段（干擾片段）的轉(zhuǎn)錄，得到足量的相應(yīng)RNA分子

。
（3）導(dǎo)入和培養(yǎng)：將D基因的表達(dá)干擾載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌。黑麥草愈傷組織在菌液中浸沒5min,先置于無菌濾紙上吸去多余的菌液，再轉(zhuǎn)入無菌水浸潤的濾紙上共培養(yǎng)3天，共培養(yǎng)的目的是

使攜帶干擾片段（目的片段）的T-DNA整合到受體細(xì)胞（黑麥草愈傷組織細(xì)胞）染色體DNA上

使攜帶干擾片段（目的片段）的T-DNA整合到受體細(xì)胞（黑麥草愈傷組織細(xì)胞）染色體DNA上

。篩選得到的愈傷組織經(jīng)

再分化

再分化

過程，培育得到再生植株。
（4）鑒定和篩選：對轉(zhuǎn)基因植株與

野生型（或非轉(zhuǎn)基因）

野生型（或非轉(zhuǎn)基因）

植株進(jìn)行木質(zhì)素含量測定與分析，篩選保留木質(zhì)素含量顯著

降低

降低

的植株。