29．（一）中國(guó)科學(xué)家運(yùn)用合成生物學(xué)方法構(gòu)建了一株嗜鹽單胞菌H，以糖蜜（甘蔗榨糖后的廢棄液，含較多蔗糖）為原料，在實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵生產(chǎn)PHA等新型高附加值可降解材料，期望提高甘蔗的整體利用價(jià)值。工藝流程如圖。PHA可從發(fā)酵液中獲取。
回答下列問(wèn)題：
（1）分解蔗糖菌株的篩選：將蔗糖作為
，經(jīng)多次傳代培養(yǎng)以獲得目標(biāo)菌株。培養(yǎng)過(guò)程中定期取樣并用
法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，評(píng)估菌株增殖狀況。如果要挑選增殖能力強(qiáng)的菌株，則可以通過(guò)比較培養(yǎng)24h菌落的
來(lái)獲得目的菌株。
（2）發(fā)酵前培養(yǎng)基通常需要滅菌，實(shí)驗(yàn)室常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌法，一般設(shè)定在121℃，
壓力下滅菌15-20min?；诰闔嗜鹽、酸堿耐受能力強(qiáng)等特性，研究人員設(shè)計(jì)了一種不需要滅菌的發(fā)酵系統(tǒng)，其培養(yǎng)基鹽濃度設(shè)為60g/L，pH為10，菌株H可正常持續(xù)發(fā)酵60d以上，根據(jù)以上信息，該系統(tǒng)不需要滅菌的原因是
。（至少答出2點(diǎn)）
（3）研究人員在工廠進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，在適宜的營(yíng)養(yǎng)物濃度、溫度、pH條件下發(fā)酵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中菌株H細(xì)胞增殖和PHA產(chǎn)量均未達(dá)到預(yù)期，并產(chǎn)生了少量乙醇等物質(zhì)，說(shuō)明發(fā)酵條件中
可能是高密度培養(yǎng)的限制因素。為了獲得PHA，可以用
發(fā)酵（1種即可）等方法進(jìn)行提取。
（二）研究發(fā)現(xiàn)人溶菌酶（hLZ）是天然抗生素替代品?？茖W(xué)家培育出轉(zhuǎn)人溶菌酶基因山羊，以大規(guī)模生產(chǎn)人溶菌酶（從乳汁中提?。?，過(guò)程如圖所示。其中編號(hào)①～⑨表示過(guò)程；質(zhì)粒S中的基因Leu通過(guò)控制相關(guān)酶的合成而影響亮氨酸的合成（亮氨酸是山羊細(xì)胞維持生命活動(dòng)必不可少的一種必需氨基酸），基因GFP控制合成綠色熒光蛋白。四種限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)見(jiàn)下表。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：
| 限制酶 |
BamHⅠ |
BglⅡ |
HindⅢ |
XbaⅠ |
| 識(shí)別序列和切割位點(diǎn) |
G↓GATCC |
A↓GATCT |
A↓AGCTT |
T↓CTAGA |
（4）過(guò)程①通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增物質(zhì)A，需要的酶是
；過(guò)程②需要的限制酶是
。
（5）為成功篩選出含重組質(zhì)粒T的成纖維細(xì)胞，質(zhì)粒S中用作標(biāo)記基因的是
。為達(dá)到篩選目的，培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分中應(yīng)不含有
。將成纖維細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間后觀察，篩選出
（選填“顯示”或“不顯示”）綠色熒光的細(xì)胞用于過(guò)程⑤。
（6）過(guò)程④常用
法，過(guò)程⑨為
。
