研究發(fā)現(xiàn)，TRIM59基因在肝癌細(xì)胞中存在異常表達(dá)，可用于原發(fā)性肝癌的早期診斷。TRIM59蛋白含有R、B、C和TM四個(gè)功能區(qū)，如圖1所示；科研人員采用一定的技術(shù)手段，獲得了TRIM59基因的cDNA，分別構(gòu)建TRIM59基因過表達(dá)及TRIM59基因敲除質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株后，過表達(dá)及敲減細(xì)胞株的增殖情況如圖2所示。
（1）圖2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明
在肝癌細(xì)胞系中，敲除TRIM59可以有效抑制細(xì)胞的增殖能力，過表達(dá)TRIM59細(xì)胞的增殖能力顯著增加
在肝癌細(xì)胞系中，敲除TRIM59可以有效抑制細(xì)胞的增殖能力，過表達(dá)TRIM59細(xì)胞的增殖能力顯著增加
。
（2）科研人員通過PCR擴(kuò)增了圖1中4種不同長(zhǎng)度的蛋白質(zhì)功能區(qū)組合片段所對(duì)應(yīng)的TRIM59基因片段，并插入圖3所示的帶FLAG標(biāo)簽序列（27bp）的載體中，與FLAG標(biāo)簽序列形成融合基因。FLAG是一種短肽，使融合蛋白能與含有FLAG抗體的介質(zhì)結(jié)合，但不影響TRIM59蛋白功能區(qū)的功能。
PCR擴(kuò)增4種不同長(zhǎng)度TRIM59基因片段需要的引物有 5
5
種；為了使目的基因正確插入，除△R對(duì)應(yīng)的TRIM59基因片段以外，在目的基因上游引物的5′端應(yīng)插入 BamHⅠ
BamHⅠ
（“BamHⅠ”或“EcoRⅠ”）的識(shí)別序列，理由是 使用EcoRⅠ會(huì)導(dǎo)致載體移碼突變，翻譯出的氨基酸序列改變
使用EcoRⅠ會(huì)導(dǎo)致載體移碼突變，翻譯出的氨基酸序列改變
；可利用PCR技術(shù)驗(yàn)證融合基因是否構(gòu)建成功，其實(shí)驗(yàn)思路是 以插入FLAG-目的基因的載體為模板，使用載體引物F和目的基因下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)是否擴(kuò)增出DNA條帶，及對(duì)應(yīng)的大小
以插入FLAG-目的基因的載體為模板，使用載體引物F和目的基因下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)是否擴(kuò)增出DNA條帶，及對(duì)應(yīng)的大小
。
（3）體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TRIM59蛋白和PPM1B蛋白有結(jié)合現(xiàn)象。為了研究?jī)傻鞍自诩?xì)胞內(nèi)是否結(jié)合，科研人員分別將FLAG-TRIM59（FL）質(zhì)粒、FLAG-TRIM59（R+B）質(zhì)粒、FLAG-TRIM59（R）質(zhì)粒、FLAG-TRIM59（△R）質(zhì)粒與帶有GFP標(biāo)簽的GFP-PPM1B質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞，以單獨(dú)轉(zhuǎn)染GFP-PPM1B質(zhì)粒的受體細(xì)胞作為對(duì)照。分別利用FLAG抗體和GFP抗體對(duì)①至⑤實(shí)驗(yàn)細(xì)胞裂解液中的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖4中膠片一、二所示。再利用GFP抗體對(duì)上述FLAG抗體免疫沉淀中的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如膠片三所示。
圖中實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明 兩蛋白在細(xì)胞內(nèi)相互結(jié)合，TRIM59蛋白通過R結(jié)構(gòu)與PPM1B結(jié)合
兩蛋白在細(xì)胞內(nèi)相互結(jié)合，TRIM59蛋白通過R結(jié)構(gòu)與PPM1B結(jié)合
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（4）研究發(fā)現(xiàn)TRIM59蛋白的R功能區(qū)具有泛素化連接酶的活性，可介導(dǎo)泛素化途徑降解PPM1B蛋白，PPM1B能夠使某種蛋白去磷酸化進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，據(jù)此可推測(cè)肝癌患者中TRIM59蛋白和PPM1B蛋白的量呈 負(fù)
負(fù)
相關(guān)。
