安莎霉素是一類主要由海洋來源的稀有放線菌產(chǎn)生的活性大環(huán)內(nèi)酰胺類次級代謝產(chǎn)物，具有較高的抗菌活性和藥用價(jià)值?？蒲腥藛T通常從深海采集淤泥樣本，再分離、純化并篩選出產(chǎn)安莎霉素的放線菌。一株海洋來源的稀有放線菌的分離培養(yǎng)流程如圖1所示。請分析回答下列問題：
（1）過程①的接種方法為
稀釋涂布平板法
稀釋涂布平板法
。
（2）統(tǒng)計(jì)菌落種類和數(shù)量時(shí)要每隔24 h觀察統(tǒng)計(jì)一次，直到各類菌落數(shù)目穩(wěn)定，以防止培養(yǎng)時(shí)間不足導(dǎo)致 遺漏菌落的種類和數(shù)目
遺漏菌落的種類和數(shù)目
，或培養(yǎng)時(shí)間太長導(dǎo)致 菌落粘連影響計(jì)數(shù)、培養(yǎng)基表面干燥脫水
菌落粘連影響計(jì)數(shù)、培養(yǎng)基表面干燥脫水
。
（3）研究人員發(fā)現(xiàn)產(chǎn)安莎霉素的放線菌具有一個(gè)普遍的共性--氨基酸缺陷型，從培養(yǎng)基成分分析，基本培養(yǎng)基與完全培養(yǎng)基存在差異的成分是 氨基酸
氨基酸
。為了初步鑒定營養(yǎng)缺陷型放線菌菌株，科研人員進(jìn)行了如下操作：
①用接種針挑取 菌落A
菌落A
（填“菌落A”或“菌落B”）接種于盛有完全液體培養(yǎng)基的離心管中，28℃振蕩培養(yǎng)3～5天后，離心取沉淀物，用無菌水洗滌3次制成菌懸液。
②吸取1 mL菌懸液加入無菌培養(yǎng)皿中，傾注15 mL融化并冷卻至50℃左右的基本培養(yǎng)基，待其冷凝后用記號筆在 皿底
皿底
（“皿蓋”或“皿底”）劃分五個(gè)區(qū)域，標(biāo)記A、B、C、D、E。
③在劃分的五個(gè)區(qū)域上放入少量分組的氨基酸粉末（如表所示），經(jīng)培養(yǎng)后，觀察生長圈出現(xiàn)的區(qū)域，從而確定屬于何種氨基酸缺陷型。
| 組別 |
所含氨基酸 |
| A |
組氨酸 |
蘇氨酸 |
谷氨酸 |
天冬氨酸 |
亮氨酸 |
| B |
精氨酸 |
蘇氨酸 |
賴氨酸 |
甲硫氨酸 |
苯丙氨酸 |
| C |
酪氨酸 |
谷氨酸 |
賴氨酸 |
色氨酸 |
丙氨酸 |
| D |
甘氨酸 |
天冬氨酸 |
甲硫氨酸 |
色氨酸 |
絲氨酸 |
| E |
半胱氨酸 |
亮氨酸 |
苯丙氨酸 |
丙氨酸 |
絲氨酸 |
在上述鑒定實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基A、D區(qū)域出現(xiàn)生長圈，說明該氨基酸缺陷型菌株屬于
天冬氨酸
天冬氨酸
缺陷型。
（4）科研人員分離、純化出產(chǎn)安莎霉素的放線菌后，需要利用PCR技術(shù)大量擴(kuò)增其染色體上的16S rRNA保守片段，然后通過DNA序列比對進(jìn)行菌種親源關(guān)系的鑒定。
①查找數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)該放線菌的16S rRNA目的基因片段及相應(yīng)限制酶識別序列如圖2所示：
16S rRNA基因片段
| 限制酶 |
EcoR I |
BamH I |
HindⅢ |
Sac I |
| 識別序列和切割位點(diǎn) |
GAATTCG |
GATCC |
AAGCTT |
GAGCTC |
為了獲得目的基因16S rRNA，需要使用的限制酶是
EcoRⅠ
EcoRⅠ
和
SacⅠ
SacⅠ
。得到目的基因以后就可以利用PCR技術(shù)對16S rRNA進(jìn)行體外擴(kuò)增，此過程需要加入
Taq酶
Taq酶
催化。
②聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對引物的特異性要求較高，放線菌是一類GC含量高的細(xì)菌，設(shè)定退火溫度時(shí)需要適當(dāng)
升高
升高
（填“升高”或“降低”）溫度，為了摸索出最適退火溫度，設(shè)定了55℃、56℃、57℃、58℃四個(gè)溫度梯度，反應(yīng)結(jié)束后，電泳檢測PCR產(chǎn)物（已知16S rRNA片段大小為1 500 dp），不同溫度對應(yīng)的結(jié)果如圖3所示，1～4四個(gè)泳道分別對應(yīng)的退火溫度是
A
A
（填字母）。
A.55℃、56℃、57℃、58℃
B.56℃、55℃、58℃、57℃
C.58℃、57℃、56℃、55℃
D.55℃、58℃、56℃、57℃
