PSMA3是蛋白酶體的重要組成成分之一,與惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系。為探尋PSMA3與肝癌細胞(HCC)的關(guān)系,科研人員通過構(gòu)建含人PSMA3基因的重組腺病毒(pAd/PSMA3)并開展了相關(guān)研究,以期為HCC早期診斷和治療奠定基礎。下圖為重組腺病毒的構(gòu)建流程,其中GFP為綠色熒光蛋白基因。請回答下列問題。
限制酵 |
識別序列 |
限制酶 |
識別序列 |
PacⅠ |
TTAAT↓TAA |
BclⅠ |
T↓GATCA |
PmeⅠ |
GTTT↓AAAC |
EcoRⅠ |
GAT↓ATC |
SalⅠ |
G↓TCGAC |
San3AⅠ |
↓GATC |
(1)過程①以提取的總mRNA為模板,在
逆(反)轉(zhuǎn)錄酶
逆(反)轉(zhuǎn)錄酶
酶的作用下獲得PSMA3的cDNA基因,該基因與人體細胞核中PSMA3基因在結(jié)構(gòu)上的區(qū)別是沒有
非編碼區(qū)(或啟動子和終止子)、內(nèi)含子
非編碼區(qū)(或啟動子和終止子)、內(nèi)含子
。
(2)為防止過程中PSMA3基因與質(zhì)粒1任意連接,可在PSMA3基因的上游和下游引物的5′端分別添加
SalⅠ、EcoRⅠ
SalⅠ、EcoRⅠ
(限制酶)的識別序列。
(3)過程④為同源重組,該過程首先需要核酸外切酶從線性化DNA分子一條鏈的末端按3′→5′的方向順次水解若干個磷酸二酯鍵,其目的是形成
黏性
黏性
末端,再經(jīng)
DNA連接
DNA連接
酶的作用形成重組腺病毒載體。
(4)過程⑥常用脂質(zhì)體包裹DNA片段,目的是
促進目的DNA片段進入239A細胞
促進目的DNA片段進入239A細胞
。轉(zhuǎn)染后,可通過熒光顯微鏡觀察
綠色熒光蛋白(GFP)
綠色熒光蛋白(GFP)
基因的表達強度來初步篩選出目標239A細胞。
(5)為進一步研究PSMA3基因?qū)Ω伟┘毎挠绊憴C制,科研人員將肝癌細胞(SMMC7721)常規(guī)培養(yǎng)48~72h后,檢測過度表達PSMA3基因?qū)毎芷诩凹毎蛲龅挠绊懀Y(jié)果如下表。
組別 |
G1 |
S |
G2 |
凋亡率 |
空白對照組 |
57.97±1.91% |
32.6l±1.07% |
9.71±0.36% |
0.178±0.037% |
空病毒感染組 |
58.18±1.96% |
32.64±0.96% |
9.59±0.32% |
0.167±0.025% |
pAd/PSMA3感染組 |
73.39±22.25% |
19.12±0.71% |
7.98±0.27% |
9.792±1.163% |
①細胞培養(yǎng)液中加入胎牛血清的作用是
為細胞提供未知的營養(yǎng)成分(或補充培養(yǎng)液中所缺乏的成分)
為細胞提供未知的營養(yǎng)成分(或補充培養(yǎng)液中所缺乏的成分)
,為防止細胞代謝物積累對細胞自身造成危害,需要
定期更換培養(yǎng)液
定期更換培養(yǎng)液
。
②結(jié)果表明,PSMA3基因過度表達能
調(diào)控細胞周期,促進細胞的凋亡
調(diào)控細胞周期,促進細胞的凋亡
,從而影響惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。
③臨床研究發(fā)現(xiàn),肝癌患者注入pAd/PSMA3后,對肝癌細胞的增殖與凋亡無影響,進一步研究發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)未檢測到pAd/PSMA3,其原因可能是
患者感染過腺病毒,體內(nèi)存在腺病毒抗體,攻擊pAd/PSMA3,使PSMA3基因無法表達出PSMA3
患者感染過腺病毒,體內(nèi)存在腺病毒抗體,攻擊pAd/PSMA3,使PSMA3基因無法表達出PSMA3
。