PSMA3是蛋白酶體的重要組成成分之一，與惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系。為探尋PSMA3與肝癌細胞（HCC）的關(guān)系，科研人員通過構(gòu)建含人PSMA3基因的重組腺病毒（pAd/PSMA3）并開展了相關(guān)研究，以期為HCC早期診斷和治療奠定基礎。下圖為重組腺病毒的構(gòu)建流程，其中GFP為綠色熒光蛋白基因。請回答下列問題。
| 限制酵 |
識別序列 |
限制酶 |
識別序列 |
| PacⅠ |
TTAAT↓TAA |
BclⅠ |
T↓GATCA |
| PmeⅠ |
GTTT↓AAAC |
EcoRⅠ |
GAT↓ATC |
| SalⅠ |
G↓TCGAC |
San3AⅠ |
↓GATC |
（1）過程①以提取的總mRNA為模板，在
逆（反）轉(zhuǎn)錄酶
逆（反）轉(zhuǎn)錄酶
酶的作用下獲得PSMA3的cDNA基因，該基因與人體細胞核中PSMA3基因在結(jié)構(gòu)上的區(qū)別是沒有
非編碼區(qū)（或啟動子和終止子）、內(nèi)含子
非編碼區(qū)（或啟動子和終止子）、內(nèi)含子
。
（2）為防止過程中PSMA3基因與質(zhì)粒1任意連接，可在PSMA3基因的上游和下游引物的5′端分別添加
SalⅠ、EcoRⅠ
SalⅠ、EcoRⅠ
（限制酶）的識別序列。
（3）過程④為同源重組，該過程首先需要核酸外切酶從線性化DNA分子一條鏈的末端按3′→5′的方向順次水解若干個磷酸二酯鍵，其目的是形成
黏性
黏性
末端，再經(jīng)
DNA連接
DNA連接
酶的作用形成重組腺病毒載體。
（4）過程⑥常用脂質(zhì)體包裹DNA片段，目的是
促進目的DNA片段進入239A細胞
促進目的DNA片段進入239A細胞
。轉(zhuǎn)染后，可通過熒光顯微鏡觀察
綠色熒光蛋白（GFP）
綠色熒光蛋白（GFP）
基因的表達強度來初步篩選出目標239A細胞。
（5）為進一步研究PSMA3基因?qū)Ω伟┘毎挠绊憴C制，科研人員將肝癌細胞（SMMC7721）常規(guī)培養(yǎng)48～72h后，檢測過度表達PSMA3基因?qū)毎芷诩凹毎蛲龅挠绊懀Y(jié)果如下表。
| 組別 |
G1 |
S |
G2 |
凋亡率 |
| 空白對照組 |
57.97±1.91% |
32.6l±1.07% |
9.71±0.36% |
0.178±0.037% |
| 空病毒感染組 |
58.18±1.96% |
32.64±0.96% |
9.59±0.32% |
0.167±0.025% |
| pAd/PSMA3感染組 |
73.39±22.25% |
19.12±0.71% |
7.98±0.27% |
9.792±1.163% |
①細胞培養(yǎng)液中加入胎牛血清的作用是
為細胞提供未知的營養(yǎng)成分（或補充培養(yǎng)液中所缺乏的成分）
為細胞提供未知的營養(yǎng)成分（或補充培養(yǎng)液中所缺乏的成分）
，為防止細胞代謝物積累對細胞自身造成危害，需要
定期更換培養(yǎng)液
定期更換培養(yǎng)液
。
②結(jié)果表明，PSMA3基因過度表達能
調(diào)控細胞周期，促進細胞的凋亡
調(diào)控細胞周期，促進細胞的凋亡
，從而影響惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。
③臨床研究發(fā)現(xiàn)，肝癌患者注入pAd/PSMA3后，對肝癌細胞的增殖與凋亡無影響，進一步研究發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)未檢測到pAd/PSMA3，其原因可能是
患者感染過腺病毒，體內(nèi)存在腺病毒抗體，攻擊pAd/PSMA3，使PSMA3基因無法表達出PSMA3
患者感染過腺病毒，體內(nèi)存在腺病毒抗體，攻擊pAd/PSMA3，使PSMA3基因無法表達出PSMA3
。
