基因工程中的載體分為克隆載體和表達(dá)載體??寺≥d體用來克隆和擴(kuò)增DNA片段,而表達(dá)載體是使外源基因在宿主細(xì)胞中有效表達(dá)。胡蘿卜抗凍蛋白基因(afp)是人類發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)植物抗凍蛋白基因,對于植物抗凍基因工程具有非常重要的意義。下表為幾種限制酶的識別序列及酶切位點(diǎn),如圖表示構(gòu)建afp基因表達(dá)載體的過程,其中PUCm-T、PBI121為人工改造后的質(zhì)粒,LacZ基因可用于重組質(zhì)粒的篩選。
限制酶 |
識別序列 |
BamHⅠ |
5′-G↓GATCC-3′ |
EcoRⅠ |
5′-G↓AATTC-3′ |
PstⅠ |
5′-C↓TGCAG-3′ |
XbaⅠ |
5′-T↓CTAGA-3′ |
SmaⅠ |
5′-CCC↓GGG-3′ |
(1)通過PCR可獲得大量的afp基因,PCR 的原理是
DNA半保留復(fù)制
DNA半保留復(fù)制
,擴(kuò)增時(shí)需選用的引物為
afp的多個(gè)A聚合的尾與PUCm-T尾端多個(gè)聚合的T可以通過堿基互補(bǔ)配對相連
afp的多個(gè)A聚合的尾與PUCm-T尾端多個(gè)聚合的T可以通過堿基互補(bǔ)配對相連
。
(2)PCR產(chǎn)物往往在引物端含有多個(gè)人聚合的尾,而PUCm T尾端由多個(gè)T聚合,所以在構(gòu)建克隆載體時(shí)不需要用限制酶處理afp和PUCm-T,理由是
引物1和引物3
引物1和引物3
。
(3)LacZ基因編碼的β-半乳糖背酶可催化乳糖的水解,培養(yǎng)基中添加物質(zhì)IPTG可誘導(dǎo)LacZ基因的表達(dá),將培養(yǎng)基中的白色物質(zhì)X-gal轉(zhuǎn)化為藍(lán)色物質(zhì)。據(jù)圖分析,成功導(dǎo)入克隆載體的大腸桿菌菌落呈
白色
白色
(填“白色”或“藍(lán)色”),理由是
成功導(dǎo)入克隆載體的大腸桿菌中,afp插入LacZ內(nèi)部,破壞了LacZ基因的結(jié)構(gòu),無法表達(dá)β-半乳糖苷酶,無法將培養(yǎng)基中的X-gal轉(zhuǎn)化為藍(lán)色物質(zhì)
成功導(dǎo)入克隆載體的大腸桿菌中,afp插入LacZ內(nèi)部,破壞了LacZ基因的結(jié)構(gòu),無法表達(dá)β-半乳糖苷酶,無法將培養(yǎng)基中的X-gal轉(zhuǎn)化為藍(lán)色物質(zhì)
。
(4)提取大腸桿菌中的克隆載體后,先用EcoRⅠ處理克隆載體,再將兩端形成的黏性末端補(bǔ)平,補(bǔ)平后再用XbaⅠ處理,得到了一端平末端,一端黏性末端的afp,同時(shí)選用
XbaⅠ和SmaⅠ
XbaⅠ和SmaⅠ
(從表中選擇) 處理PBI121質(zhì)粒,然后用DNA連接酶將PBI121與alp進(jìn)行連接,構(gòu)成afp基因表達(dá)載體。在此過程中,使afp的兩端形成不同的末端的意義是
可以防止afp倒接,防止afp自身環(huán)化
可以防止afp倒接,防止afp自身環(huán)化
。