學(xué)習(xí)以下材料，回答（1）～（4）題。
基因魔剪：CRISPR/Cas系統(tǒng)CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)可對(duì)真核細(xì)胞的基因組進(jìn)行特異編輯。CRISPR/Cas9系統(tǒng)由Cas9蛋白和人工設(shè)計(jì)的gRNA構(gòu)成。在gRNA引導(dǎo)下，Cas9與靶序列結(jié)合并將DNA雙鏈切斷（通過設(shè)計(jì)gRNA中20個(gè)堿基的識(shí)別序列，可人為選擇DNA上的任一目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行切割）。隨后細(xì)胞通過自身的DNA損傷修復(fù)機(jī)制，將斷裂上下游兩端的序列連接起來，但通常會(huì)在斷裂處造成少量核苷酸的插入或缺失。當(dāng)DNA雙鏈斷裂后，如果細(xì)胞中有DNA修復(fù)模板（由需要插入的目的基因和靶序列上下游的同源序列組成），斷裂部分可依據(jù)修復(fù)模板進(jìn)行精確修復(fù)，從而將目的基因插入到指定位點(diǎn)（圖1）。
科學(xué)家通過在Cas9基因中引入突變，獲得了只切割DNA一條鏈的nCas9，并將nCas9與胞嘧啶脫氨酶或腺嘌呤脫氨酶融合，開發(fā)出了單堿基編輯技術(shù)（圖2），能夠?qū)Π形稽c(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)的堿基編輯，最終可以分別實(shí)現(xiàn)C→T（G→A）或A→G（T→C）的堿基替換。對(duì)CRISPR/Cas系統(tǒng)改造后，還可用于激活或者抑制基因的轉(zhuǎn)錄等。
目前CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)存在一定的脫靶效應(yīng)：正常情況下，gRNA通過20個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的引導(dǎo)序列與目標(biāo)DNA序列發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)準(zhǔn)確識(shí)別需要編輯的位點(diǎn)，然而有時(shí)會(huì)發(fā)生第18～20個(gè)堿基不匹配的情況，此時(shí)，Cas9可通過一個(gè)手指狀的結(jié)構(gòu)緊緊抓住錯(cuò)配區(qū)穩(wěn)定住RNA-DNA雙鏈，從而為Cas9切割DNA鋪平道路，但這可能會(huì)導(dǎo)致Cas9在錯(cuò)誤的基因位點(diǎn)切割雙鏈DNA，從而引發(fā)潛在風(fēng)險(xiǎn)。
盡管如此，CRISPR/Cas系統(tǒng)作為一種革命性的技術(shù)，其成本低、制作簡(jiǎn)便、快捷高效等優(yōu)點(diǎn)讓它迅速風(fēng)靡于世界各地的實(shí)驗(yàn)室，成為科研、醫(yī)療等領(lǐng)域的有效工具。
（1）利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯，需構(gòu)建含gRNA基因和Cas9基因的
基因表達(dá)載體（或重組DNA分子、重組質(zhì)粒）
基因表達(dá)載體（或重組DNA分子、重組質(zhì)粒）
，并導(dǎo)入受體細(xì)胞。Cas9蛋白與 限制
限制
酶的功能相似。gRNA依據(jù) 堿基互補(bǔ)配對(duì)
堿基互補(bǔ)配對(duì)
原則與靶序列特異性結(jié)合，引導(dǎo)Cas9蛋白進(jìn)行切割。
（2）若用CRISPR/Cas9系統(tǒng)將某一基因從基因組序列中刪除，需要設(shè)計(jì)2個(gè)gRNA，使其分別與 靶基因兩端
靶基因兩端
的序列互補(bǔ)。有些遺傳病是由于基因中一個(gè)堿基對(duì)改變引起的，若要修正此基因突變，文中圖示的3種途徑中，③
③
（填“①”“②”或“③”）更為合適。
（3）研究者通過一些技術(shù)讓Cas9基因發(fā)生突變，使Cas9蛋白失去切割活性，可將CRISPR/Cas9用于抑制基因轉(zhuǎn)錄，實(shí)施的過程為：在gRNA的引導(dǎo)下，Cas9蛋白與靶基因的 啟動(dòng)子
啟動(dòng)子
結(jié)合，使 RNA聚合酶
RNA聚合酶
失去結(jié)合位點(diǎn)從而抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。
（4）請(qǐng)結(jié)合文章，提出降低CRISPR/Cas9系統(tǒng)脫靶效應(yīng)的思路。設(shè)計(jì)gRNA的長(zhǎng)度為17個(gè)堿基，避免第18～20個(gè)堿基不匹配時(shí)，導(dǎo)致錯(cuò)誤位點(diǎn)的切割（或設(shè)計(jì)出特異性較強(qiáng)的gRNA，增強(qiáng)gRNA的特異性；通過設(shè)計(jì)Cas9，讓其手指狀結(jié)構(gòu)遠(yuǎn)離DNA序列，從而在gRNA與DNA錯(cuò)配時(shí)，不會(huì)穩(wěn)定錯(cuò)配結(jié)構(gòu)，避免在錯(cuò)誤位點(diǎn)切割等）
設(shè)計(jì)gRNA的長(zhǎng)度為17個(gè)堿基，避免第18～20個(gè)堿基不匹配時(shí)，導(dǎo)致錯(cuò)誤位點(diǎn)的切割（或設(shè)計(jì)出特異性較強(qiáng)的gRNA，增強(qiáng)gRNA的特異性；通過設(shè)計(jì)Cas9，讓其手指狀結(jié)構(gòu)遠(yuǎn)離DNA序列，從而在gRNA與DNA錯(cuò)配時(shí)，不會(huì)穩(wěn)定錯(cuò)配結(jié)構(gòu)，避免在錯(cuò)誤位點(diǎn)切割等）
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