24．TGFβ信號(hào)通路可通過(guò)S蛋白去磷酸化抑制癌細(xì)胞增殖，與該過(guò)程有關(guān)的N蛋白磷酸化后被激活，可使S蛋白發(fā)生磷酸化。藥物SPD可通過(guò)影響R蛋白來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)TGF-β信號(hào)通路的響應(yīng)。為探索藥物SPD治療癌癥的機(jī)理，科研人員通過(guò)構(gòu)建基因表達(dá)載體來(lái)獲得融合蛋白S-HA、N-HA和R-HA。HA是一種短肽，連接在S、N或R蛋白的羧基端（不影響S、N或R的功能），細(xì)胞中只有帶HA標(biāo)簽的融合蛋白能與介質(zhì)上的HA抗體結(jié)合，從而分離得到HA標(biāo)簽融合蛋白。構(gòu)建融合蛋白S-HA基因表達(dá)載體的模式圖如圖1（注：雙鏈DNA的一條鏈?zhǔn)蔷幋a鏈，另一條鏈?zhǔn)寝D(zhuǎn)錄的模板鏈）。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：
（1）啟動(dòng)子是
酶識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)；組成HA的基本單位是
。
（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增S基因并保證其兩端存在限制酶NheⅠ和HindⅢ的識(shí)別序列時(shí)，需添加的一對(duì)引物是
（選填下面的數(shù)字序號(hào)）。在反應(yīng)體系中添加的dNTP的作用是提供
和
。
①5'GCTAGCATGGAC3'
②5'CAGGTACGATCG3'
③5'AAGCTTCCATGGCC3'
④5'AAGCTTTCAGTCTA3'
（3）將擴(kuò)增后的S基因插入載體上，構(gòu)建圖1所示的S-HA融合基因表達(dá)載體。將重組載體導(dǎo)入大腸桿菌前，先用Ca2+處理大腸桿菌的目的是使其成為
。篩選出符合要求的受體菌后，經(jīng)適宜條件培養(yǎng)，表達(dá)出的蛋白質(zhì)有S蛋白的氨基酸序列但沒(méi)有HA的氨基酸序列，據(jù)圖1分析，出現(xiàn)該問(wèn)題的原因是S基因編碼
未刪除，導(dǎo)致融合基因翻譯提前終止，未表達(dá)出HA的氨基酸序列。
（4）融合蛋白表達(dá)成功并分離得到R-HA和磷酸化的S-HA、N-HA。將三種融合蛋白按照如表所示的組合方式分別在緩沖液中進(jìn)行反應(yīng)，檢測(cè)S-HA和N-HA的磷酸化水平。據(jù)檢測(cè)結(jié)果推測(cè)R蛋白的作用是對(duì)S蛋白和N蛋白
。
| 分組 |
|
① |
② |
③ |
④ |
| 組合方式 |
R-HA |
- |
+ |
- |
+ |
| P-S-HA |
+ |
+ |
- |
- |
| P-N-HA |
- |
- |
+ |
+ |
| 檢測(cè)結(jié)果 |
P-S-HA |
|
|
|
|
| P-N-HA |
|
|
|
|
“+”表示有；“-”表示無(wú)；“P”表示融合蛋白的磷酸化
（5）向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度SPD，處理相同時(shí)間，通過(guò)電泳檢測(cè)細(xì)胞中R蛋白水平，結(jié)果如圖2所示。綜合以上研究結(jié)果推測(cè)，藥物SPD治療癌癥的機(jī)理可能是：SPD通過(guò)促進(jìn)
，直接或間接降低
水平，從而抑制癌細(xì)胞的增殖。
