TGFβ信號通路可通過S蛋白去磷酸化抑制癌細胞增殖，與該過程有關的N蛋白磷酸化后被激活，可使S蛋白發(fā)生磷酸化。藥物SPD可通過影響R蛋白來增強細胞對TGF-β信號通路的響應。為探索藥物SPD治療癌癥的機理，科研人員通過構建基因表達載體來獲得融合蛋白S-HA、N-HA和R-HA。HA是一種短肽，連接在S、N或R蛋白的羧基端（不影響S、N或R的功能），細胞中只有帶HA標簽的融合蛋白能與介質(zhì)上的HA抗體結合，從而分離得到HA標簽融合蛋白。構建融合蛋白S-HA基因表達載體的模式圖如圖1（注：雙鏈DNA的一條鏈是編碼鏈，另一條鏈是轉(zhuǎn)錄的模板鏈）。請回答下列問題：

（1）啟動子是

RNA聚合

RNA聚合

酶識別和結合的位點；組成HA的基本單位是

氨基酸

氨基酸

。
（2）利用PCR技術擴增S基因并保證其兩端存在限制酶NheⅠ和HindⅢ的識別序列時，需添加的一對引物是

①③

①③

（選填下面的數(shù)字序號）。在反應體系中添加的dNTP的作用是提供

原料

原料

和

能量

能量

。
①5'GCTAGCATGGAC3'
②5'CAGGTACGATCG3'
③5'AAGCTTCCATGGCC3'
④5'AAGCTTTCAGTCTA3'
（3）將擴增后的S基因插入載體上，構建圖1所示的S-HA融合基因表達載體。將重組載體導入大腸桿菌前，先用Ca²⁺處理大腸桿菌的目的是使其成為

感受態(tài)細胞

感受態(tài)細胞

。篩選出符合要求的受體菌后，經(jīng)適宜條件培養(yǎng)，表達出的蛋白質(zhì)有S蛋白的氨基酸序列但沒有HA的氨基酸序列，據(jù)圖1分析，出現(xiàn)該問題的原因是S基因編碼

終止密碼子

終止密碼子

未刪除，導致融合基因翻譯提前終止，未表達出HA的氨基酸序列。
（4）融合蛋白表達成功并分離得到R-HA和磷酸化的S-HA、N-HA。將三種融合蛋白按照如表所示的組合方式分別在緩沖液中進行反應，檢測S-HA和N-HA的磷酸化水平。據(jù)檢測結果推測R蛋白的作用是對S蛋白和N蛋白

去磷酸化有促進作用

去磷酸化有促進作用

。

分組		①	②	③	④
組合方式	R-HA	-	+	-	+
	P-S-HA	+	+	-	-
	P-N-HA	-	-	+	+
檢測結果	P-S-HA
	P-N-HA

“+”表示有；“-”表示無；“P”表示融合蛋白的磷酸化
（5）向細胞培養(yǎng)液中加入不同濃度SPD，處理相同時間，通過電泳檢測細胞中R蛋白水平，結果如圖2所示。綜合以上研究結果推測，藥物SPD治療癌癥的機理可能是：SPD通過促進

R蛋白表達或者促進R蛋白表達對S蛋白去磷酸化

R蛋白表達或者促進R蛋白表達對S蛋白去磷酸化

，直接或間接降低

S蛋白的磷酸化水平

S蛋白的磷酸化水平

水平，從而抑制癌細胞的增殖。