PCR定點突變技術(shù)是最常用的基因突變技術(shù)，通過定點誘變可以在體外改造DNA分子。重疊延伸PCR是發(fā)展最早的PCR定點突變技術(shù)，操作過程如圖1，可通過測序來檢驗定點突變是否成功?，F(xiàn)欲將改造后的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌，質(zhì)粒結(jié)構(gòu)如圖2。

回答下列問題：
（1）PCR的原理是

DNA雙鏈復(fù)制

DNA雙鏈復(fù)制

；圖1所示重疊延伸PCR中，第1對引物是

突變引物FP2和通用引物RP2

突變引物FP2和通用引物RP2

；在第1對引物組成的反應(yīng)系統(tǒng)和第2對引物組成的反應(yīng)系統(tǒng)中各進行一次復(fù)制，可產(chǎn)生

3

3

種DNA分子。
（2）圖1所示DNA分子不能延伸，原因是

DNA單鏈延伸的方向必須是5’到3’

DNA單鏈延伸的方向必須是5’到3’

。
（3）分析圖1和圖2，要將突變的基因定向插入質(zhì)粒并構(gòu)建表達載體，應(yīng)如何設(shè)計通用引物FP1和通用引物RP2？

應(yīng)保證突變基因右側(cè)應(yīng)是CTAG

應(yīng)保證突變基因右側(cè)應(yīng)是CTAG

。
（4）為篩選出含有目的基因的大腸桿菌，通常采用影印法（使用無菌的絨氈布壓在培養(yǎng)基A的菌落上，帶出少許菌種，平移并壓在培養(yǎng)基B上，結(jié)果如圖3），培養(yǎng)基A中應(yīng)添加

氨芐青霉素

氨芐青霉素

，培養(yǎng)基B中應(yīng)添加

四環(huán)素

四環(huán)素

，含有重組質(zhì)粒的菌落是

4、6

4、6

（填寫數(shù)字）。