近年來，科學(xué)家利用基因工程技術(shù)創(chuàng)造出許多優(yōu)良品種或產(chǎn)品。如圖為獲得抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米的技術(shù)路線，其中含有內(nèi)含子的報(bào)告基因只能在真核生物中正確表達(dá)，其產(chǎn)物能催化無色物質(zhì)K呈現(xiàn)藍(lán)色。請回答以下問題：

（1）獲得抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米的過程中核心步驟是

基因表達(dá)載體構(gòu)建

基因表達(dá)載體構(gòu)建

。
（2）為防止酶切產(chǎn)物自身環(huán)化，需使用

2

2

種限制酶，分別對含除草劑抗性基因G的DNA片段和Ti-質(zhì)粒上的

T-DNA

T-DNA

（填“報(bào)告基因”、“T-DNA”、“氨芐青霉素抗性基因”） 進(jìn)行酶切。
（3）為提高轉(zhuǎn)化成功率，常用含

Ca²⁺

Ca²⁺

的溶液處理土壤農(nóng)桿菌，使其成為感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化成功的農(nóng)桿菌應(yīng)在含

氨芐青霉素

氨芐青霉素

的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選1。
（4）農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)“報(bào)告基因”表達(dá)后

不能

不能

（填“能”或“不能”）能催化無色物質(zhì)K呈現(xiàn)藍(lán)色，原因是

報(bào)告基因中的內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA序列在農(nóng)桿菌中不能被切除，導(dǎo)致農(nóng)桿菌內(nèi)“報(bào)告基因”翻譯的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不同，不具相應(yīng)的酶活性，無法催化無色物質(zhì)K呈現(xiàn)藍(lán)色

報(bào)告基因中的內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA序列在農(nóng)桿菌中不能被切除，導(dǎo)致農(nóng)桿菌內(nèi)“報(bào)告基因”翻譯的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不同，不具相應(yīng)的酶活性，無法催化無色物質(zhì)K呈現(xiàn)藍(lán)色

。
（5）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化愈傷組織的過程中，愈傷組織表面常殘留農(nóng)桿菌，會導(dǎo)致未轉(zhuǎn)化的愈傷組織可能在含除草劑的培養(yǎng)基中生長。所以進(jìn)行過程篩選2時，應(yīng)在培養(yǎng)基中加入

除草劑和物質(zhì)K

除草劑和物質(zhì)K

，并挑選

愈傷組織細(xì)胞內(nèi)呈顯藍(lán)色

愈傷組織細(xì)胞內(nèi)呈顯藍(lán)色

的植物細(xì)胞，進(jìn)行

植物組織培養(yǎng)

植物組織培養(yǎng)

獲得抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米幼苗。