科研人員通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出超量表達(dá)P蛋白的轉(zhuǎn)基因甜玉米。在超量表達(dá)P基因載體的構(gòu)建中，含P基因的DNA片段以及Ti質(zhì)粒的酶切位點(diǎn)如圖所示，其中強(qiáng)啟動(dòng)子能驅(qū)動(dòng)基因的持續(xù)轉(zhuǎn)錄。請回答下列問題。
| 限制酶 |
識(shí)別序列 |
| ClaⅠ |
5′-AT↓CGAT-3′ |
| BamHⅠ |
5′-G↓GATCC-3′ |
| HindⅢ |
5′-A↓AGCTT-3′ |
| EcoRⅠ |
5′-G↓AATTC-3′ |
| KpnⅠ |
5′-GGTAC↓C-3′ |
| SacⅠ |
5′-GAGCT↓C-3′ |
（1）以RNA為模板，通過RT-PCR技術(shù)可獲取P基因。進(jìn)行RT-PCR時(shí)一般要加入4種脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）而不是脫氧核苷酸，其原因是
dNTP 能為子鏈延伸過程提供能量和原料（或脫氧核苷酸只能作為原料而不能提供能量）
dNTP 能為子鏈延伸過程提供能量和原料（或脫氧核苷酸只能作為原料而不能提供能量）
，同時(shí)需加入的酶有
逆轉(zhuǎn)錄酶和 Taq酶
逆轉(zhuǎn)錄酶和 Taq酶
。為了特異性擴(kuò)增P基因序列，需根據(jù)
P基因兩端的堿基序列
P基因兩端的堿基序列
設(shè)計(jì)特異性引物。
（2）在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，應(yīng)優(yōu)先選用的限制酶是
BamHⅠ
BamHⅠ
和
Sac I
Sac I
，這樣操作不僅使P基因在玉米植株中超量表達(dá)，還可利用T-DNA的
可轉(zhuǎn)移
可轉(zhuǎn)移
特性，最終使P基因
整合到玉米細(xì)胞染色體上
整合到玉米細(xì)胞染色體上
。
（3）將農(nóng)桿菌液浸泡過的玉米愈傷組織進(jìn)行植物組織培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基中需加入
潮霉素
潮霉素
，篩選出的愈傷組織經(jīng)再分化過程形成叢芽，最終獲得轉(zhuǎn)基因玉米植株。
（4）對(duì)轉(zhuǎn)基因再生玉米植株進(jìn)行鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)，有些植株雖有P基因，但幾乎沒有P蛋白，造成該現(xiàn)象的原因可能有
基因轉(zhuǎn)化過程中強(qiáng)啟動(dòng)子可能丟失或斷裂，未能真正轉(zhuǎn)化成功；雖然轉(zhuǎn)化成功，但是P基因保持沉默，不能有效表達(dá)
基因轉(zhuǎn)化過程中強(qiáng)啟動(dòng)子可能丟失或斷裂，未能真正轉(zhuǎn)化成功；雖然轉(zhuǎn)化成功，但是P基因保持沉默，不能有效表達(dá)
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